【摘要】：腎結(jié)石是泌尿外科常見病,發(fā)病率僅次于尿路感染和前列腺疾病,是泌尿外科第三大多發(fā)病,且具有較高復(fù)發(fā)率,臨床常表現(xiàn)為腎臟功能損害和尿路梗阻。目前腎結(jié)石疾病的形成機(jī)制尚不明確,已有研究表明蛋白質(zhì)與腎結(jié)石形成密切相關(guān),在結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著重要作用�；|(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白(MGP)是由多個谷氨酸殘基構(gòu)成的維生素K依賴的分泌蛋白,在人體中多個組織器官中均有表達(dá)。目前已經(jīng)確認(rèn)其在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)鈣化過程中起重要作用,且已發(fā)現(xiàn)其對血管鈣化有抑制作用,并可能與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein,BMP-2)的相互作用有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)MGP蛋白與腎結(jié)石形成也有密切相關(guān)性,其可能有抑制結(jié)晶形成的功能,但分子機(jī)制尚不清楚。而系統(tǒng)篩選和研究MGP的相互作用蛋白,能進(jìn)一步闡明其與腎結(jié)石形成的關(guān)系和分子機(jī)制。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過T7噬菌體展示系統(tǒng)從人cDNA文庫中釣取MGP相互作用蛋白,并對其與互作蛋白之間的相互作用進(jìn)行初步研究。首先,我們以pT7CFE1-NHis-GST-CHA為載體構(gòu)建哺乳動物真核表達(dá)系統(tǒng)用的MGP表達(dá)質(zhì)粒pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP,通過蛋白體外表達(dá)系統(tǒng)得到大量的人源MGP蛋白。接著以體外表達(dá)得到的人MGP蛋白為誘餌蛋白,在ELISA板上進(jìn)行包被,然后使用人cDNA文庫T7噬菌體展示系統(tǒng),篩選可能與MGP存在相互作用的多肽,Phage EILSA法進(jìn)一步篩選驗(yàn)證所得多肽是否與MGP存在相互作用,篩選確認(rèn)了SLC27A6等12個與MGP可能存在相互作用的候選互作蛋白。最后利用分子模擬的方法對MGP蛋白及SLC27A6進(jìn)行了同源建模和分子對接研究,在計(jì)算機(jī)水平上確認(rèn)了其存在相互作用,并初步研究了其蛋白相互作用的方式。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了MGP的高效表達(dá)質(zhì)粒,并在體外實(shí)現(xiàn)了MGP蛋白的高效表達(dá),再以得到的MGP蛋白為誘餌蛋白,利用T7噬菌體表達(dá)篩選系統(tǒng)在體外成功的篩選驗(yàn)證得到了MGP的12個候選相互作用蛋白,為進(jìn)一步研究MGP蛋白抑制腎結(jié)石形成的分子機(jī)制以及其他生理功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692.4
【圖文】：

圖 1-2 pMD19-MGP 質(zhì)粒 EcoR I 和 Xho I 雙酶切鑒定A Ladder；2,3：pMD19-MGP 質(zhì)粒未經(jīng) EcoR I 和 Xho I 雙酶切；4,5：經(jīng) EcoR I 和 Xho I 雙酶切后的產(chǎn)物 的結(jié)果顯示 5 號泳道中質(zhì)粒 pMD19-MGP 經(jīng)過 Eco

1-3 pT7CFE1-NHis-GST-CHA 質(zhì)粒和 pMD19-MGP 質(zhì)粒 EcoR I 和 Xho I 電泳圖M：DL5000 DNA Makre；1：pT7CFE1-NHis-GST-CHA 質(zhì)粒未經(jīng) EcoR I 和 Xho I 雙酶切pT7CFE1-NHis-GST-CHA 質(zhì)粒經(jīng) EcoR I 和 Xho I 雙酶切后產(chǎn)物；3：pMD19-MGP 質(zhì)粒未和 Xho I 雙酶切；3-5：pMD19-MGP質(zhì)粒經(jīng) EcoR I 和 Xho I雙酶切后的產(chǎn)物

1-4 重組質(zhì)粒 pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP 的 EcoR I 和 Xho I 雙酶切M：DL5000 DNA Makre；1：未雙酶切的重組 pT7CFE1-Nhis-GST-CHA-MGP 質(zhì)粒2：重組質(zhì)粒 pT7CFE1-Nhis-GST-CHA-MGP 經(jīng) EcoR I 和 Xho I 雙酶切后的產(chǎn)物圖 1-4 顯示，2 號泳道的質(zhì)粒經(jīng)過酶切驗(yàn)證后在 4400bp 和 310b分片段，片段大小分別與 pT7CFE1-NHis-GST-CHA 和-MGP cD合。證明我們成功構(gòu)建了 pT7CFE1-NHis-GST-CHA-MGP 重組質(zhì)進(jìn)一步的擴(kuò)增、純化及體外表達(dá)。BCA 法測定 MGP 蛋白濃度們采用 BCA 蛋白測定方法對 1.3.5.2 所得的蛋白體外表達(dá)反應(yīng)液，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白反應(yīng)液稀釋 10 倍后，由紫外分光光度計(jì)測得其 595nm 處吸其蛋白濃度為 4mg/ml。

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本文編號：2749471