發(fā)布時間：2020-07-06 06:46

【摘要】：腎腫瘤是泌尿生殖系統(tǒng)常見的腫瘤,其治療手段以手術為主,放化療、免疫治療、血管栓塞及各種能量消融等輔助治療手段主要用于晚期腎腫瘤,但均不能取得滿意療效。近年來,大量臨床實驗顯示靶向藥物療效優(yōu)于傳統(tǒng)治療方法,索拉菲尼便是其中之一,使多數(shù)患者受益。然而,仍有部分患者腫瘤進展得不到有效控制,其原因可能與腫瘤細胞對靶向藥物耐藥有關。產生耐藥的機制復雜,其中腫瘤細胞自噬與此密切相關,而Akt信號通路是調節(jié)腫瘤細胞自噬關鍵通路之一。因此本文圍繞索拉菲尼治療晚期腎腫瘤臨床療效評價及部分患者腫瘤進展原因展開研究,探討自噬及Akt信號通路在其中的作用機制,并將論文分為三部分:第一部分,評價索拉非尼治療晚期腎癌的療效及不良反應,大多數(shù)患者腫瘤得到控制,但仍有少部分患者腫瘤進展,這與瘤細胞對索拉菲尼敏感性降低有關;第二部分,通過調節(jié)自噬水平,增敏腎癌索拉菲尼治療敏感性,探討通過烏苯美司逆轉瘤細胞索拉菲尼耐藥的可行性,恢復索拉菲尼對瘤細胞療效;第三部分,探討Akt信號通路在烏苯美司增強索拉菲尼敏感性及抑制腎癌細胞侵襲性中的作用。由此可以明確烏苯美司通過抑制Akt信號通路調節(jié)自噬,逆轉瘤細胞索拉菲尼耐藥,恢復索拉菲尼敏感性,Akt信號通路在其中起關鍵作用,并且烏苯美司通過抑制Akt信號通路可以抑制腎癌細胞侵襲性,提示索拉菲尼聯(lián)合烏苯美司可能是一種治療晚期腎癌的新策略,并取得更優(yōu)療效,單用索拉菲尼治療后腫瘤仍進展的患者可能因此受益,但這需要后期的臨床實驗證實。第一部分索拉非尼治療晚期腎癌的療效及不良反應背景腎癌是臨床上最常見的泌尿系腫瘤之一,占成人惡性腫瘤的4%,占成人腎惡性腫瘤的80-90%。在中國,腎癌影響45.3萬人,每年造成39.6萬人死亡。發(fā)達國家的發(fā)病率高于發(fā)展中國家,男性的發(fā)病率高于女性。導致腎癌的主要因素包括吸煙、酗酒和肥胖。腎癌早期無明顯癥狀,患者出現(xiàn)血尿、疼痛、腫塊的癥狀多提示晚期,并且發(fā)生了腫瘤轉移。目前,外科治療仍是腎癌的主要治療方法。然而,32%的腎癌患者術后仍會發(fā)生復發(fā)和轉移。晚期患者生存期6-12個月,5年生存率10%。傳統(tǒng)的治療方法如放療、化療和干擾素僅對10-30%的患者有效。近年來,大量臨床開放性三期試驗表明,靶向藥物治療晚期腎癌優(yōu)于放射化療和干擾素,耐受性好,不良反應小。癌癥治療已進入靶向治療的時代。索拉非尼作為一種激酶抑制劑,抑制多種細胞外和細胞內激酶,具有雙重抗腫瘤和抗血管生成作用。它能抑制MRK和RAF信號通路以及VECFR、PDGFR和腫瘤新生血管,已成為治療晚期腎癌的一線靶向藥物。本研究分析了山東大學(中國,濟南)附屬山東省立醫(yī)院索拉非尼治療晚期腎癌的臨床資料,并對其療效、副作用及預后進行了分析,為晚期腎癌的治療提供了參考。目的本研究目的在于評價索拉非尼治療晚期腎癌的療效和安全性。方法觀察組包括從2010年1月至2013年8月應用索拉非尼+干擾素治療的74例晚期腎癌患者。另外53名僅用干擾素治療的病例作為對照組。我們把這些病例的臨床一手資料收集集中,然后進行回顧性分析。治療方案:索拉非尼初始劑量為400毫克,每天兩次。所有患者每隔一天用300MU干擾素治療。根據(jù)Recist標準記錄無進展生存率(PFS)、總生存率(OS)和不良反應發(fā)生率來評估療效。結果觀察組中,總生存時間中位數(shù)為15.3個月(范圍,9-60個月),無進展生存時間中位數(shù)為8.2個月(范圍,2-36個月)。完全緩解(CR)的患者有4例(5.41%),部分緩解(PR)有16例(21.62%),病情穩(wěn)定(SD)有42例(56.76%),病情進展有12例(16.22%),疾病控制率(DCR)為83.78%(62例)。對照組中,總生存時間中位數(shù)為12.5個月(范圍,8-60個月),無進展生存時間中位數(shù)為 9.3 個月(范圍,2-40 個月)。CR2 例(3.77%),PR11 例(20.75%),SD 20例(37.74%),疾病進展20例(37.74%),疾病控制率為62.26%(33例)。觀察組的疾病控制率明顯高于對照組(P0.05)。主要不良反應為皮膚反應、發(fā)熱、腹瀉、疲勞、皮疹、食欲不振、高血壓、脫發(fā)、肝功能異常。結論索拉非尼靶向治療晚期腎癌有較高的疾病控制率,不良反應可控、可耐受。第二部分通過調節(jié)自噬水平,增敏腎癌索拉菲尼治療敏感性背景自噬是溶酶體依賴性降解機制。真核細胞中自噬現(xiàn)象并不少見,通過這種方式促進細胞內蛋白降解,分解細胞漿成分,使其得以循環(huán)利用,維護細胞穩(wěn)態(tài)。腫瘤細胞同樣存在自噬現(xiàn)象,通過這種方式提高自身耐藥性,與腫瘤的生物學特性密切相關。有學者對自噬進行深入研究認為,可以通過作用于自噬相關信號通路從而影響靶向治療敏感性。通常認為,自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了雙刃劍的角色。當腫瘤在面臨化療或者靶向治療壓力的時候,自噬往往會發(fā)揮作用,這是一種調控方式,可以使胞內蛋白分解,胞漿中的某些成分得以釋放,細胞可以再次利用這些成分,維護細胞穩(wěn)態(tài),并使細胞度過能量危機,從而達到逃避治療的目的。而過度的自噬則會啟動細胞的程序性死亡,這種死亡有別于壞死性死亡以及程序性細胞凋亡,其典型特征表現(xiàn)為自噬小體的形成以及自噬相關基因的表達,這種程序性死亡被稱作Ⅱ型程序性死亡,也就是說過度的自噬,則可以導致細胞的死亡。烏苯美司是一種常用的抗腫瘤藥物,本身屬于APN抑制劑,其被廣泛應用于臨床當中,有效的發(fā)揮作用,也受到了學者們的普遍關注,其藥理學機制目前處于探索當中。有學者對該藥物進行研究,發(fā)現(xiàn)其在腎癌中可以發(fā)揮有效的抗腫瘤效果,這與其阻斷5-LO-LTA4水解酶途徑密切相關。我們前期對烏苯美司的作用機制進行研究,將其用于腎癌細胞,發(fā)現(xiàn)該藥可以誘導后者出現(xiàn)自噬性死亡。由此可見,該藥物可以調節(jié)腫瘤細胞自噬,對于放療及靶向治療具有調節(jié)潛力。國外近期研究指出,自噬不僅可以防止受損或不必要成分的積累,還可以回收降解細胞內成分以維持代謝同態(tài)性。這個過程中,beclin-1在beclin-l-vps34-vpsl5核心復合物的形成中起著重要作用,這是自噬誘導所必需的。MIR可以調節(jié)自噬途徑。例如,mir-30a和mir-376b被證明能夠抑制beclin-1的活性,從而阻止自噬小泡成核和自噬起始。此外,mir-101是一種有效的自噬抑制劑,盡管它抑制了 rab5a,一種調節(jié)早期自噬體形成的小GTP酶。在目前的研究中,我們發(fā)現(xiàn),在一些人的腎細胞癌組織和細胞系中,自噬相關的mir-30a被下調,可能導致beclin-1在腎細胞癌中上調。在有或無化療藥物刺激的癌細胞中發(fā)現(xiàn)高水平的自噬激活,參與化療抵抗。因此,阻斷自噬正在成為一種新的策略,以提高化療對各種癌癥的敏感性。例如,Yu等人指出mir-30a介導的自噬抑制能顯著增強伊馬替尼誘導的人慢性髓系白血病細胞的活性。前期我們證明了索拉非尼對RCC細胞的治療誘導了自噬激活,這也參與了化療抵抗。利用藥理學或遺傳學方法阻斷自噬可顯著增強索拉非尼對RCC細胞的細胞毒性。氯喹(CQ)是一種增加溶酶體內酸堿度以破壞自噬蛋白降解的溶酶體性藥物。已知3-甲基腺嘌呤(3-MA)可阻斷LC3B-Ⅰ到LC3B-Ⅱ的轉化,并抑制自噬體的形成。B-黃曲霉素A1(BAF-A1)通過抑制自噬體和溶酶體之間的融合來阻止自噬泡的成熟。這些針對自噬不同階段的不同抑制劑,都增強了索拉非尼對RCC細胞的活性,提示索拉非尼的自噬激活是一種促生存的重要化療抵抗因子。這一結論得到了BECLIN-1或ATG-5致敏索拉非尼的RNAi沉默在RCC細胞中誘導細胞毒性的事實的進一步支持。綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)表明,RCC中的mir-30a失調可能通過自噬依賴性途徑干擾索拉非尼介導的細胞凋亡的有效性,從而代表了 RCC中一個新的潛在治療靶點。通過結合我們的預試驗結果和前期研究者的研究證明,無論是化療放療,還是靶向治療,都有可能導致保護性自噬水平的上調,更多的研究則證明保護性自噬在腫瘤產生耐藥性的過程當中起了重要的作用。這充分說明了自噬具有高度的復雜性和背景依賴性。因此充分闡明自噬在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用,以及在耐藥性產生的作用,具有非常重要的意義。此外,我們需要進一步證實烏苯美司這種作用是否與調節(jié)自噬水平相關,只有充分認識自噬在腫瘤耐藥性當中的作用,才能更好的利用這種藥物,輔助腎癌的靶向治療。目的本文主要研究調節(jié)自噬對腎癌細胞索拉菲尼敏感性的影響,通過實驗論證的方式探索烏苯美司對于腎癌細胞的影響,該藥物可以使其對索拉菲尼敏感性增強。方法(1)梯度加壓構建索拉非尼耐藥細胞株。IC50論證耐藥細胞株的耐藥性。觀察在不同濃度索拉非尼作用下耐藥及非耐藥細胞株的活性變化。(2)引入western blot檢測不同濃度索拉非尼作用下細胞株的自噬相關指標P62和LC3B等,明確他們的表達情況。(3)觀察烏苯美司處理前后耐藥細胞株對索拉非尼敏感性變化。(4)檢測烏苯美司處理前后耐藥細胞株細胞凋亡程度變化。(5)應用烏苯美司處理前后細胞內自噬小體數(shù)量有所不同,可以用電鏡檢測發(fā)生的變化,通過上述方式驗證自噬。(6)通過上述方式確定所需要的癌細胞株,主要選擇對索拉菲尼耐藥的植株,用其構建荷瘤小鼠模型。對小鼠進行灌胃處理,分為三組,為索拉菲尼聯(lián)合烏苯美司組,索拉非尼組及對照組(DMSO)。經過上述步驟后處理小鼠,測量了解腫瘤體積,從而證實烏苯美司同索拉非尼合用能夠增強對腫瘤的抑制效果。結果(1)梯度加壓構建索拉非尼耐藥細胞株成功。IC50驗證耐藥細胞株具有耐藥性。在相同濃度索拉非尼作用下耐藥細胞株較非耐藥細胞株的具有更高的活性。(2)不同濃度索拉非尼作用下細胞株的自噬相關指標P62和LC3B等出現(xiàn)劑量依賴性變化,濃度越高自噬水平越高,說明索拉非尼可引起瘤細胞自噬水平升高。(3)耐藥細胞株對索拉非尼敏感性降低,加用烏苯美司后其敏感性增高。(4)烏苯美司處理前后耐藥細胞株細胞凋亡程度明顯增加,說明烏苯美司促進耐藥細胞株凋亡,從而逆轉索拉非尼耐藥。(5)應用烏苯美司處理前后細胞內自噬小體數(shù)量明顯下降,說明烏苯美司有調低瘤細胞自噬的作用。(6)對荷瘤小鼠進行灌胃處理,索拉非尼組較對照組腫瘤體積縮小,而索拉菲尼聯(lián)合烏苯美司組,腫瘤體積縮小更為明顯,從而證實烏苯美司聯(lián)合索拉菲尼較單用索拉非尼有更好的腫瘤抑制效果。結論(1)腎癌細胞索拉非尼獲得性耐藥的產生與自噬上調相關。(2)上調腎癌細胞自噬水平,可導致腎癌細胞株對索拉菲尼敏感性下調。(3)使用烏苯美司處理腎癌細胞可導致腎癌細胞內自噬水平降低,恢復耐藥腎癌細胞株索拉菲尼敏感性。(4)體內試驗進一步證實,烏苯美司與索拉菲尼聯(lián)合應用可以增強抑制腫瘤的效果,使腫瘤生長受到控制。第三部分Akt信號通路在烏苯美司增強索拉菲尼敏感性及抑制腎癌細胞侵襲性中的作用背景自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,受到多條信號通路調控,其中Akt通路與之密切相關,同時也影響著索拉菲尼敏感性。雖然已有一些研究調查了細胞對分子靶向藥物(包括舒尼替尼)的獲得性耐藥的分子機制,但對于腎細胞癌(RCC),但這種機制仍然很不清楚。國外研究指出,在舒尼替尼治療期間維持蛋白激酶活化可能涉及在RCC中獲得對舒尼替尼具有抗性的表型,使用靶向活化蛋白激酶治療可能是克服RCC對舒尼替尼的耐藥性有希望的方法。以前的幾項研究表明,信號轉導通路參與對多種分子靶向藥物耐藥性的產生。通過研究靶向治療前后ACHN亞系中主要信號轉導途徑的狀態(tài)證實,盡管在治療前ACHN亞系中磷酸化Akt和MAPK的表達水平沒有明顯不同,但ACHN/RAkt和MAPK的磷酸化受到了顯著抑制;然而,在治療后,ACHN/R中可檢測到Akt和MAPK途徑的激活。此外,通過用PI3K特異性抑制劑LY294002進行輔助治療,可克服ACHN/R細胞對靶向治療的獲得性耐藥性。同樣,以前的幾項研究已經證明了抑制Akt通路對克服各種細胞毒性藥物的獲得性耐藥的潛在作用;例如,彭等人提出,與對順鉑敏感的對照物相比,順鉑耐藥細胞表達較高水平的活化Akt,并且Akt或mTOR途徑的抑制使這些抗性細胞對順鉑誘導的細胞凋亡敏感�？偟膩碚f,這些研究結果表明,在治療期間Akt信號通路的激活,特別是PI3K/Akt通路,可能與RCC細胞獲得該試劑的耐藥性表型有關,且有希望通過這些通路的特異性抑制劑來克服。目的探討Akt信號通路在烏苯美司增強索拉菲尼敏感性及抑制腎癌細胞侵襲性中的作用。方法(1)腎癌細胞Akt信號通路受烏苯美司的影響,經后者處理后其磷酸化水平發(fā)生變化,可以引入Weston Blot法檢測其影響程度。(2)烏苯美司可以有助于增加腎癌索拉菲尼敏感性,而Akt信號通路在其中發(fā)揮作用,可以通過實驗論證其過程。Akt激動劑可以作用于腎癌細胞,使Akt信號發(fā)生變化,從而起到對其調節(jié)作用。烏苯美司和索拉菲尼聯(lián)合后加入Akt激動劑,觀察前者對索拉具有增敏作用的變化,以證實抑制Akt信號可以增強索拉菲尼的正面效果。(3)在腎癌細胞侵襲方面,烏苯美司可以對其產生影響,這一點能夠利用Transwell實驗加以驗證。烏苯美司可以作用于腎癌細胞,使癌細胞的侵襲能力發(fā)生變化,再加入Akt激動劑后觀察其帶來的變化。結果烏苯美司處理腎癌細胞時,觀察Akt信號通路變化情況,結果發(fā)現(xiàn)其磷酸化水平明顯下降。(2)使用Akt激動劑IGF-1(10nM)后,聯(lián)合應用烏苯美司和索拉菲尼瘤細胞的耐藥性有所恢復。故而提示烏苯美司有增加索拉菲尼敏感性的作用,而前者抑制Akt信號通路的功效是發(fā)揮上述效果的重要作用機制。(3)對于腎癌細胞的侵襲能力來說,通過Tmnswell實驗并未發(fā)現(xiàn)索拉菲尼具有明顯促進作用,但將其與烏苯美司聯(lián)合后,腎癌的侵襲能力有所下降,受到一定程度抑制。(4)如果上調腎癌細胞內Akt信號后,將會使瘤細胞侵襲力能力增強,這一過程需要使用Akt激動劑。由此可見烏苯美司具有明確抑制瘤細胞侵襲作用,從而其轉移受到抑制,抑制Akt信號在這個過程中發(fā)揮重要作用。結論(1)烏苯美司通過增強腎癌細胞索拉菲尼敏感性,而抑制Akt信號通路是達到上述目的的重要機制。(2)腫瘤細胞本身具有侵襲性,聯(lián)合烏苯美司和索拉菲尼可以產生抑制作用,削弱癌細胞侵犯其他組織能力,其作用與抑制Akt信號通路密切相關。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.11
【圖文】：

圖２兩組患者生存率比較，觀察組５年生存率明顯高于對照組逡逑（ｐ＜０．０５）邋0逡逑

圖２不同濃度索拉非尼作用下耐藥細胞株顯示出較非耐藥細胞顯示出較高細胞逡逑活力

圖３邋Ａｋｔ通路在索拉非尼耐藥細胞中被激活。ｐ－ａｋｔ－ｓｅｒ４７３水平呈劑量依賴性增逡逑力口，但總ａｋｔ表達無差異。作為ｐ－ａｋｔ－ｓｅｒ４７３的下游效應物，ｐ－ｍｔｏｒ－ｓｅｒ２４８１表現(xiàn)逡逑出相似的變化。索拉非尼耐藥細胞具有較高的ａｋｔ通路效應器表達和自噬水平逡逑（ｌｃ３ｂ邋和邋ｐ６２邋數(shù)量）。逡逑

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄒文英;薛昌紅;劉陽;張晉蔚;蘇藝偉;周文慧;劉移民;;Akt信號通路在二氧化硅誘導RAW264.7細胞磷酸化的作用[J];中國職業(yè)醫(yī)學;2019年01期

2 歐陽雪巖;朱朕;楊超;王麗;姜峰;丁罡;;焦慮狀態(tài)下去甲腎上腺素激活Akt信號通路對乳腺癌作用研究[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2019年07期

3 邱文瀚;王德娟;胡成;黃文濤;張慧敏;何建文;李一淵;邱劍光;李科;;長鏈脂酰輔酶A合成酶3介導Akt信號通路調控前列腺癌進展的研究[J];中華腔鏡泌尿外科雜志(電子版);2018年01期

4 GU S H;LIN P L;HSIEH H Y;劉露露;;蠶素/Akt信號通路參與家蠶胚胎滯育過程[J];廣西蠶業(yè);2019年02期

5 張春燕;陶忠樺;陳川寧;甘淋;;FXR通過Akt信號通路調節(jié)人肝癌細胞SMMC-7721的細胞增殖[J];西南醫(yī)科大學學報;2017年05期

6 朱宏文;喻溥蛟;許嘉鴻;;miR-19b通過激活Akt信號通路保護心肌細胞凋亡[J];上海大學學報(自然科學版);2019年01期

7 張霞;薛文郁;薛雁明;;生長激素釋放肽調控Akt信號通路對高糖誘導的胰島β細胞凋亡的影響[J];中國老年學雜志;2019年06期

8 徐川;李亞楠;譙丹;古歡;鐘羅;吳鍵;于濤;;MicroRNA-9影響涎腺腺樣囊性癌侵襲能力的分子機制研究[J];口腔醫(yī)學研究;2019年06期

9 劉特思;呂游;閆文帝;王雪;劉小慶;樸英實;林貞花;任香善;;蟲草素通過ERK1/2、Ezrin和Akt信號通路抑制膽囊癌細胞SNU-308的增殖和遷移[J];中國病理生理雜志;2018年08期

10 江琳琳;張全安;鄭勤;胡勤剛;魏魁杰;韓偉;;干擾素γ對舌鱗癌細胞增殖影響的研究[J];口腔醫(yī)學研究;2011年08期

相關會議論文 前2條

1 聶海濤;劉浩;郭藝璇;王鋒;;基于Akt信號通路研究黃體期營養(yǎng)水平對湖羊卵泡發(fā)育的影響[A];2017年全國養(yǎng)羊生產與學術研討會暨養(yǎng)羊學分會第七次全國會員代表大會論文集[C];2017年

2 張學婭;黃熙;任平;許東云;張穎;羅珊珊;王曉雨;;中藥復方冠心Ⅱ號心臟保護的抗凋亡及抗炎機理研究[A];第六屆全國中西醫(yī)結合基礎理論研究學術研討會暨第二屆湖南省中西醫(yī)結合學會肝病專業(yè)學術年會論文集[C];2010年

相關博士學位論文 前2條

1 仇鞠輝;調節(jié)自噬及Akt信號通路增敏腎癌索拉菲尼靶向治療敏感性的研究[D];山東大學;2019年

2 趙杰;TET3-5hmC表觀遺傳學修飾與Akt信號通路在激素性股骨頭壞死中的作用研究[D];天津醫(yī)科大學;2017年

相關碩士學位論文 前6條

1 倪灣;洋蔥槲皮素抗炎活性及對NF-κB和Akt信號通路的影響[D];錦州醫(yī)科大學;2019年

2 梁辰;肢體缺血后處理改善大鼠慢性腦缺血對Akt信號通路和自噬及LIONG-1的影響[D];濟南大學;2017年

3 林建貴;RNA干擾Jagged1基因對腎透明細胞癌細胞的影響及其機制的研究[D];福建醫(yī)科大學;2014年

4 揭平輝;激活TRPV4受體對海馬神經元存活的作用及其分子機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2015年

5 趙琳琳;中期因子誘導肝癌細胞抗失巢凋亡的作用及其分子機制的研究[D];蘇州大學;2013年

6 徐勇;DNA-PKcs-SIN1復合物介導的低劑量X射線促進AKT活化及成骨細胞分化[D];蘇州大學;2015年

本文編號：2743297