【摘要】：背景與目的 腎細胞癌(Renal Cell Carcinoma, RCC)約占成人惡性腫瘤的2%-3%,全球每年有超過20萬例新發(fā)病例及超過10萬例死亡病例。約1/3的RCC患者就診前已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,約1/3的局限性RCC患者術后復發(fā)。在我國,RCC在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二,且發(fā)病率逐年上升,如何防治RCC的復發(fā)和轉(zhuǎn)移成為目前腎癌治療中面臨的重要挑戰(zhàn)。 腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段,并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。1869年,Ashworth在1例晚期腫瘤患者外周血中發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞類似的細胞,首次提出了循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell, CTC)這一概念。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)被定義為自惡性腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞,它具有腫瘤特異性抗原或基因特征,在外周血中檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC)并進行分析研究,對明確轉(zhuǎn)移過程、輔助診斷、監(jiān)測療效、指導個體化治療、判斷預后等方面具有重要的臨床應用價值。 目前對于CTC的檢測有50余種方法,歸納起來包括以免疫反應為基礎的檢測方法、熒光定量PCR方法及以細胞過濾為基礎的檢測方法。目前較成熟的方法是Veridex公司開發(fā)的Cellsearch技術,CellSearch技術是美國食品和藥品管理局(Food and Drug Adm inistration, FDA)唯一批準的用于檢測CTC的方法。它是一種半自動技術,通過載有抗EpCAM抗體的鐵磁流體富集CTC,隨后CTC用CK和DAPI熒光抗體染色,其余血細胞用CD45對比染色,CK+/DAPI+/CD45-細胞使用自動熒光顯微鏡進行計數(shù)。 CTC的檢測包括富集和鑒定兩個步驟,富集方法包括基于特異性免疫識別原理以及基于細胞形態(tài)學差異的富集方法。以免疫識別為基礎的檢測方法的局限在于,僅可識別典型的表達上皮抗原的CTC,不能識別發(fā)生上皮細胞間質(zhì)變(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的CTC以及循環(huán)腫瘤細胞團(Circulating Tumor Microemboli, CTM),有文獻認為其漏檢率可達50%。 膜濾過分離腫瘤細胞技術(Isolation by Size of Epithelial Tumor cells, IS ET)是一種不依賴于相關抗原抗體反應而直接過濾外周血進行腫瘤細胞富集的技術,根據(jù)腫瘤細胞體積大于外周血中粒細胞,從而使腫瘤細胞從外周血中分離出來,它減小了腫瘤細胞的丟失且不會破壞腫瘤細胞的形態(tài)學特征,同時也在很大程度上提高了檢測的敏感性。已有研究證明在乳腺癌和肺癌的檢測中,ISET法富集效率高于免疫磁性富集法。 目前,對腎癌患者外周血CTC檢測的相關研究較少被報道,本實驗擬分別以CellSearch法及ISET法檢測腎癌患者外周血CTC,并與各臨床病理特征及以往研究結果對比,尋找針對腎癌外周血CTC檢測的合理方法,并討論腎癌患者外周血CTC檢測的臨床意義。 資料與方法 1研究對象 2013年7月至2014年7月山東省腫瘤醫(yī)院收治的腎透明細胞癌患者82例,其中男性63例,女性19例,年齡33-72歲,平均63歲。根據(jù)病理分期,Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例；根據(jù)病理分級,1級患者8例,2級患者32例,3級患者27例,4級患者15例。2013年7月選取20名經(jīng)影像學檢查證實健康的山東省腫瘤醫(yī)院醫(yī)務人員作為健康志愿者。所有受試者均排除有放化療史及其他抗腫瘤治療史。本實驗已經(jīng)山東省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批并出具書面審批書,開始實驗前,所有受試者均已征得本人及家屬的同意,并簽署知情同意書。 2方法 2.1樣本采集與處理 于腎癌患者術前1天空腹采血,健康受試者空腹采血,均取肘正中靜脈為穿刺點,采血量15m1,隨機取7.5m1于CellSearch專用Cellsave儲存管,樣本寄送至上海鼎晶公司,96h內(nèi)以Cell-acks(?)AutoPrep(?)系統(tǒng)檢測；隨機取7.5m1于EDTA抗凝管(BD),24h內(nèi)在山東省腫瘤醫(yī)院中心實驗室以武漢友芝友公司CTC-Biopsy檢測儀檢測。 2.2CellSearch法檢測流程 以強生公司Celltracks(?)AutoPrep(?)自動檢測系統(tǒng)檢測樣本。結果分析(細胞判讀)：分析儀分析后,點擊Review圖標,根據(jù)CTC免疫熒光染色特性,表達CK+DAPI+CD45-空白通道-的細胞為CTC,對掃描后結果進行判定。 2.3CTC-Biopsy檢測儀(I SET法)檢測流程 以武漢友芝友生物公司CTC-Biopsy異常細胞分離染色儀檢測樣本。根據(jù)Hofman VJ等報道的ISET法CTC判讀標準：細胞核大小變異大(比率0.5)；細胞核大于24μm；細胞核形狀不規(guī)則；染色質(zhì)染色存在三維層次；高核質(zhì)比,只要同時符合以上至少4個特征,就可從形態(tài)學上認為是CTC。由細胞室病理醫(yī)師判讀結果。 3資料整理登記CellSearch法及ISET法檢測結果,登記受試者的臨床病理特征,列表記錄。 4統(tǒng)計方法應用SPSS19.0統(tǒng)計學分析軟件及Excel2003軟件行統(tǒng)計學分析及圖表制作,單因素分析采用四格表Fisher確切概率法、行列表Fisher確切概率法和Kendall相關分析法,P0.05認為有統(tǒng)計學意義,多因素分析用logistic回歸分析法,P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果 1CeIISearch法及I SET法檢測健康受試者外周血結果 本次實驗檢測健康志愿者20例,CellSearch法及ISET法檢測外周血均未發(fā)現(xiàn)CTC。 2GellSerach法檢測腎癌患者外周血CTC結果及與臨床病理特征的比較 2.1CellSerach法檢測腎癌患者外周血CTC結果 接受檢測的82例腎透明細胞癌患者中,外周血CTC數(shù)目≥1的有18例,根據(jù)病理分期,Ⅰ期2例、Ⅱ期1例、Ⅲ期3例,Ⅳ期12例；根據(jù)病理分級,1級2例、2級8例、3級2例、4級6例；外周血CTC數(shù)目≥2的有11例,根據(jù)病理分期,Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期1例、Ⅳ期8例；根據(jù)病理分級1級2例、2級5例、3級1例、4級3例。 82例腎癌患者中,病理切片發(fā)現(xiàn)微血管浸潤的患者13例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2；腫瘤中有組織壞死的患者22例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2。伴肉瘤樣變的患者9例,其中3例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2；集合系統(tǒng)受累的患者7例,其中2例CTC數(shù)目≥1,0例CTC數(shù)目≥2。ECOG評分≥1的患者9例,其中4例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。血小板計數(shù)≥450×109/L的患者7例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2。血紅蛋白低于正常值的患者18例,其中4例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。中性粒細胞與淋巴細胞比值≥3.6的患者16例,其中6例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。 2.2CellSearch法CTC檢測結果與腎癌患者臨床病理特征的相關性研究 單因素分析,以Fisher確切概率法及Kendall相關分析法為統(tǒng)計方法,得出結論,取cutoff值為1時,CTC結果與臨床分期被低估、病理分期、微血管浸潤及血小板≥450×109/L相關(P0.05)；取cutoff值為2時,CTC結果與淋巴結轉(zhuǎn)移及病理分期相關(P0.05)。多因素logistic回歸分析,取cutoff值為1時,CTC結果與病理分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤中有組織壞死相關。取cutoff值為2時,CTC結果與病理分期、病理分級、肉瘤樣改變、NLR≥13.6相關。 3ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結果及與臨床病理特征的比較 3.1ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結果 接受檢測的82例腎透明細胞癌患者中,28例患者外周血CTC檢測陽性,4例患者外周血CTM陽性。其中根據(jù)病理分期,Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例；根據(jù)病理分級,1級患者8例,2級患者32例,3級患者27例,4級患者15例。 82例腎癌患者中,病理切片發(fā)現(xiàn)微血管浸潤的患者13例,其中9例CTC陽性,2例CTM陽性；腫瘤中發(fā)現(xiàn)組織壞死的患者22例,其中9例CTC陽性,1例CTM陽性；伴肉瘤樣變的患者9例,其中3例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM；集合系統(tǒng)受累的患者7例,其中1例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM; ECOG評分≥1的患者9例,其中5例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM；血小板計數(shù)≥7450×109/L的患者7例,其中5例CTC陽性,1例CTM陽性；血紅蛋白低于正常值的患者18例,其中6例CTC陽性,2例CTM陽性；中性粒細胞與淋巴細胞比值≥3.6的患者16例,其中9例CTC陽性,2例CTM陽性。3.2ISET法CTC檢測結果與腎癌患者臨床病理特征的相關性研究 單因素分析,以Fisher確切概率法及Kendall相關分析法為統(tǒng)計方法,得出結論,ISET法檢測CTC結果與淋巴結轉(zhuǎn)移、病理分期、微血管浸潤、血小板≥450×10-/L及NLR-3.6相關(P0.05)；CTM結果只與病理分期相關(P0.05)。多因素logistic回歸分析,CTC結果與病理分期、遠處臟器轉(zhuǎn)移、病理分級、肉瘤樣變、血紅蛋白低于正常值相關。CTM陽性病例數(shù)過少,以至于無法篩出有影響的變量。 結論 1CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC可行,取cutoff值為1時,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為5.9%(2/34)、7.1%(1/14)、23.1%(3/13)、57.1%(12/21)；取cutoff值為2時,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為2.9%(1/34)、7.1%(1/14)、7.7%(1/13)、38.1%(12/21)； 2CellSearch法檢測腎癌外周血CTC敏感性為21.9%(18/82),健康受試者未檢出CTC,因此其特異性為100%； 3根據(jù)單因素及多因素分析,CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC結果與病理分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤中有組織壞死、肉瘤樣改變、中性粒細胞計數(shù)/淋巴細胞計數(shù)≥3.6等多個臨床病理因素相關,推測CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC可用于提示腎癌預后； 4ISET法檢測腎癌患者外周血CTC可行,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為5.9%(2/34)、28.6%(4/14)、76.9%(10/13)、57.1%(12/21)；病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTM檢出率分別為0(0/34)、0(0/14)、15.4%(2/13)、9.5%(2/21)。 5ISET法檢測腎癌患者外周血CTC敏感性為34.1%(28/82),健康受試者未檢出CTC,因此其特異性為100%。 6根據(jù)單因素及多因素分析,ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結果與病理分期、遠處臟器轉(zhuǎn)移、病理分級、肉瘤樣變、血紅蛋白低于正常值等多個臨床病理因素相關,推測ISET法檢測腎癌患者外周血CTC可用于提示腎癌預后。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【參考文獻】

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1 蔣蔚峰;張賀龍;;外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測的研究進展[J];臨床腫瘤學雜志;2010年10期

2 Ioannis A Voutsadakis;;Thrombocytosis as a prognostic marker in gastrointestinal cancers[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年02期

本文編號：2740934