【摘要】：背景與目的 腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma, RCC)約占成人惡性腫瘤的2%-3%,全球每年有超過20萬例新發(fā)病例及超過10萬例死亡病例。約1/3的RCC患者就診前已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,約1/3的局限性RCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)。在我國,RCC在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二,且發(fā)病率逐年上升,如何防治RCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為目前腎癌治療中面臨的重要挑戰(zhàn)。 腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段,并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。1869年,Ashworth在1例晚期腫瘤患者外周血中發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞類似的細(xì)胞,首次提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell, CTC)這一概念。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)被定義為自惡性腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,它具有腫瘤特異性抗原或基因特征,在外周血中檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)并進(jìn)行分析研究,對明確轉(zhuǎn)移過程、輔助診斷、監(jiān)測療效、指導(dǎo)個體化治療、判斷預(yù)后等方面具有重要的臨床應(yīng)用價值。 目前對于CTC的檢測有50余種方法,歸納起來包括以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法、熒光定量PCR方法及以細(xì)胞過濾為基礎(chǔ)的檢測方法。目前較成熟的方法是Veridex公司開發(fā)的Cellsearch技術(shù),CellSearch技術(shù)是美國食品和藥品管理局(Food and Drug Adm inistration, FDA)唯一批準(zhǔn)的用于檢測CTC的方法。它是一種半自動技術(shù),通過載有抗EpCAM抗體的鐵磁流體富集CTC,隨后CTC用CK和DAPI熒光抗體染色,其余血細(xì)胞用CD45對比染色,CK+/DAPI+/CD45-細(xì)胞使用自動熒光顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。 CTC的檢測包括富集和鑒定兩個步驟,富集方法包括基于特異性免疫識別原理以及基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異的富集方法。以免疫識別為基礎(chǔ)的檢測方法的局限在于,僅可識別典型的表達(dá)上皮抗原的CTC,不能識別發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)變(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的CTC以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞團(tuán)(Circulating Tumor Microemboli, CTM),有文獻(xiàn)認(rèn)為其漏檢率可達(dá)50%。 膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)(Isolation by Size of Epithelial Tumor cells, IS ET)是一種不依賴于相關(guān)抗原抗體反應(yīng)而直接過濾外周血進(jìn)行腫瘤細(xì)胞富集的技術(shù),根據(jù)腫瘤細(xì)胞體積大于外周血中粒細(xì)胞,從而使腫瘤細(xì)胞從外周血中分離出來,它減小了腫瘤細(xì)胞的丟失且不會破壞腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,同時也在很大程度上提高了檢測的敏感性。已有研究證明在乳腺癌和肺癌的檢測中,ISET法富集效率高于免疫磁性富集法。 目前,對腎癌患者外周血CTC檢測的相關(guān)研究較少被報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)擬分別以CellSearch法及ISET法檢測腎癌患者外周血CTC,并與各臨床病理特征及以往研究結(jié)果對比,尋找針對腎癌外周血CTC檢測的合理方法,并討論腎癌患者外周血CTC檢測的臨床意義。 資料與方法 1研究對象 2013年7月至2014年7月山東省腫瘤醫(yī)院收治的腎透明細(xì)胞癌患者82例,其中男性63例,女性19例,年齡33-72歲,平均63歲。根據(jù)病理分期,Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例；根據(jù)病理分級,1級患者8例,2級患者32例,3級患者27例,4級患者15例。2013年7月選取20名經(jīng)影像學(xué)檢查證實(shí)健康的山東省腫瘤醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員作為健康志愿者。所有受試者均排除有放化療史及其他抗腫瘤治療史。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)山東省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批并出具書面審批書,開始實(shí)驗(yàn)前,所有受試者均已征得本人及家屬的同意,并簽署知情同意書。 2方法 2.1樣本采集與處理 于腎癌患者術(shù)前1天空腹采血,健康受試者空腹采血,均取肘正中靜脈為穿刺點(diǎn),采血量15m1,隨機(jī)取7.5m1于CellSearch專用Cellsave儲存管,樣本寄送至上海鼎晶公司,96h內(nèi)以Cell-acks(?)AutoPrep(?)系統(tǒng)檢測；隨機(jī)取7.5m1于EDTA抗凝管(BD),24h內(nèi)在山東省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室以武漢友芝友公司CTC-Biopsy檢測儀檢測。 2.2CellSearch法檢測流程 以強(qiáng)生公司Celltracks(?)AutoPrep(?)自動檢測系統(tǒng)檢測樣本。結(jié)果分析(細(xì)胞判讀)：分析儀分析后,點(diǎn)擊Review圖標(biāo),根據(jù)CTC免疫熒光染色特性,表達(dá)CK+DAPI+CD45-空白通道-的細(xì)胞為CTC,對掃描后結(jié)果進(jìn)行判定。 2.3CTC-Biopsy檢測儀(I SET法)檢測流程 以武漢友芝友生物公司CTC-Biopsy異常細(xì)胞分離染色儀檢測樣本。根據(jù)Hofman VJ等報(bào)道的ISET法CTC判讀標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核大小變異大(比率0.5)；細(xì)胞核大于24μm；細(xì)胞核形狀不規(guī)則；染色質(zhì)染色存在三維層次；高核質(zhì)比,只要同時符合以上至少4個特征,就可從形態(tài)學(xué)上認(rèn)為是CTC。由細(xì)胞室病理醫(yī)師判讀結(jié)果。 3資料整理登記CellSearch法及ISET法檢測結(jié)果,登記受試者的臨床病理特征,列表記錄。 4統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件及Excel2003軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表制作,單因素分析采用四格表Fisher確切概率法、行列表Fisher確切概率法和Kendall相關(guān)分析法,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,多因素分析用logistic回歸分析法,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1CeIISearch法及I SET法檢測健康受試者外周血結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)檢測健康志愿者20例,CellSearch法及ISET法檢測外周血均未發(fā)現(xiàn)CTC。 2GellSerach法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果及與臨床病理特征的比較 2.1CellSerach法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果 接受檢測的82例腎透明細(xì)胞癌患者中,外周血CTC數(shù)目≥1的有18例,根據(jù)病理分期,Ⅰ期2例、Ⅱ期1例、Ⅲ期3例,Ⅳ期12例；根據(jù)病理分級,1級2例、2級8例、3級2例、4級6例；外周血CTC數(shù)目≥2的有11例,根據(jù)病理分期,Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期1例、Ⅳ期8例；根據(jù)病理分級1級2例、2級5例、3級1例、4級3例。 82例腎癌患者中,病理切片發(fā)現(xiàn)微血管浸潤的患者13例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2；腫瘤中有組織壞死的患者22例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2。伴肉瘤樣變的患者9例,其中3例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2；集合系統(tǒng)受累的患者7例,其中2例CTC數(shù)目≥1,0例CTC數(shù)目≥2。ECOG評分≥1的患者9例,其中4例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。血小板計(jì)數(shù)≥450×109/L的患者7例,其中6例CTC數(shù)目≥1,2例CTC數(shù)目≥2。血紅蛋白低于正常值的患者18例,其中4例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值≥3.6的患者16例,其中6例CTC數(shù)目≥1,1例CTC數(shù)目≥2。 2.2CellSearch法CTC檢測結(jié)果與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性研究 單因素分析,以Fisher確切概率法及Kendall相關(guān)分析法為統(tǒng)計(jì)方法,得出結(jié)論,取cutoff值為1時,CTC結(jié)果與臨床分期被低估、病理分期、微血管浸潤及血小板≥450×109/L相關(guān)(P0.05)；取cutoff值為2時,CTC結(jié)果與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期相關(guān)(P0.05)。多因素logistic回歸分析,取cutoff值為1時,CTC結(jié)果與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤中有組織壞死相關(guān)。取cutoff值為2時,CTC結(jié)果與病理分期、病理分級、肉瘤樣改變、NLR≥13.6相關(guān)。 3ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果及與臨床病理特征的比較 3.1ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果 接受檢測的82例腎透明細(xì)胞癌患者中,28例患者外周血CTC檢測陽性,4例患者外周血CTM陽性。其中根據(jù)病理分期,Ⅰ期患者34例、Ⅰ期患者14例、Ⅲ期患者13例、Ⅳ期患者21例；根據(jù)病理分級,1級患者8例,2級患者32例,3級患者27例,4級患者15例。 82例腎癌患者中,病理切片發(fā)現(xiàn)微血管浸潤的患者13例,其中9例CTC陽性,2例CTM陽性；腫瘤中發(fā)現(xiàn)組織壞死的患者22例,其中9例CTC陽性,1例CTM陽性；伴肉瘤樣變的患者9例,其中3例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM；集合系統(tǒng)受累的患者7例,其中1例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM; ECOG評分≥1的患者9例,其中5例CTC陽性,未發(fā)現(xiàn)CTM；血小板計(jì)數(shù)≥7450×109/L的患者7例,其中5例CTC陽性,1例CTM陽性；血紅蛋白低于正常值的患者18例,其中6例CTC陽性,2例CTM陽性；中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值≥3.6的患者16例,其中9例CTC陽性,2例CTM陽性。3.2ISET法CTC檢測結(jié)果與腎癌患者臨床病理特征的相關(guān)性研究 單因素分析,以Fisher確切概率法及Kendall相關(guān)分析法為統(tǒng)計(jì)方法,得出結(jié)論,ISET法檢測CTC結(jié)果與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、微血管浸潤、血小板≥450×10-/L及NLR-3.6相關(guān)(P0.05)；CTM結(jié)果只與病理分期相關(guān)(P0.05)。多因素logistic回歸分析,CTC結(jié)果與病理分期、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、病理分級、肉瘤樣變、血紅蛋白低于正常值相關(guān)。CTM陽性病例數(shù)過少,以至于無法篩出有影響的變量。 結(jié)論 1CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC可行,取cutoff值為1時,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為5.9%(2/34)、7.1%(1/14)、23.1%(3/13)、57.1%(12/21)；取cutoff值為2時,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為2.9%(1/34)、7.1%(1/14)、7.7%(1/13)、38.1%(12/21)； 2CellSearch法檢測腎癌外周血CTC敏感性為21.9%(18/82),健康受試者未檢出CTC,因此其特異性為100%； 3根據(jù)單因素及多因素分析,CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤中有組織壞死、肉瘤樣改變、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)≥3.6等多個臨床病理因素相關(guān),推測CellSearch法檢測腎癌患者外周血CTC可用于提示腎癌預(yù)后； 4ISET法檢測腎癌患者外周血CTC可行,病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTC檢出率分別為5.9%(2/34)、28.6%(4/14)、76.9%(10/13)、57.1%(12/21)；病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者CTM檢出率分別為0(0/34)、0(0/14)、15.4%(2/13)、9.5%(2/21)。 5ISET法檢測腎癌患者外周血CTC敏感性為34.1%(28/82),健康受試者未檢出CTC,因此其特異性為100%。 6根據(jù)單因素及多因素分析,ISET法檢測腎癌患者外周血CTC結(jié)果與病理分期、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移、病理分級、肉瘤樣變、血紅蛋白低于正常值等多個臨床病理因素相關(guān),推測ISET法檢測腎癌患者外周血CTC可用于提示腎癌預(yù)后。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 蔣蔚峰;張賀龍;;外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測的研究進(jìn)展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2010年10期

2 Ioannis A Voutsadakis;;Thrombocytosis as a prognostic marker in gastrointestinal cancers[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年02期

本文編號：2740934