【摘要】：目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)流行率在全世界范圍內(nèi)逐漸增加,已成為最主要的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于CKD的治療手段仍然很有限,迫切需要開發(fā)新的治療策略來延緩CKD的進(jìn)展。腎臟纖維化是多種CKD發(fā)展演變?yōu)槟I衰竭的必經(jīng)階段,以足細(xì)胞數(shù)目減少和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積為主要特征。在眾多致病因素中,腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)的主要活性肽—血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)作為有效刺激因子,在足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞及間質(zhì)成纖維細(xì)胞激活、炎癥細(xì)胞募集、ECM蛋白合成增多及蛋白尿增加等方面起重要作用,是導(dǎo)致腎臟纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素。脂聯(lián)素(adiponectin,Ap N)作為一種脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子,由于其改善胰島素抵抗,抗炎及血管保護(hù)特性而備受關(guān)注。流行病學(xué)資料表明Ap N在肥胖及糖尿病中下調(diào)。但是,在CKD中Ap N升高而非降低,目前其機(jī)制尚不清楚。已有研究證實(shí),在部分腎切除慢性進(jìn)展性腎臟病的動(dòng)物模型中,Ap N基因敲除的小鼠表現(xiàn)為蛋白尿,腎小球肥大,氧化應(yīng)激,足突融合和腎小管間質(zhì)纖維化加重,可通過Ap N治療有所改善。另一項(xiàng)研究表明,利用病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染過表達(dá)Ap N可緩解鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病大鼠蛋白尿。我們研究組的晚近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示利用重組Ap N治療可減少db/db小鼠的蛋白尿及腎小球硬化指標(biāo),Ap N抗纖維化作用不依賴于其降糖及改善胰島素敏感作用,可能是通過其抗炎和拮抗血管緊張素而發(fā)揮作用,Ap N可減輕Ang II和TGFβ刺激腎小球系膜細(xì)胞導(dǎo)致的纖維化指標(biāo)。但是,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,Ap N對(duì)Ang II誘導(dǎo)腎損傷的作用及機(jī)制方面的研究目前未見報(bào)道�；谶@些發(fā)現(xiàn),我們假設(shè)在基因修飾動(dòng)物水平上,Ap N可緩解脫氧醋酸皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone acetate,DOCA)-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)腎臟損傷,是一種潛在的治療CKD的新選擇。為了證明這一假設(shè),我們構(gòu)建可誘導(dǎo)型人源性全長Ap N轉(zhuǎn)基因小鼠,利用DOCA-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)腎損傷模型,觀察Ap N是否能夠緩解DOCA-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)的腎損傷及其機(jī)制。研究方法:1、通過DNA體外重組技術(shù)獲得目的基因,將目的基因切除,純化并通過顯微注射引入C57BL/6J小鼠單細(xì)胞胚胎中。通過PCR技術(shù)鑒定兩個(gè)陽性雌性首建鼠。用轉(zhuǎn)基因表達(dá)的首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠進(jìn)行育種。隨后的陽性轉(zhuǎn)基因F1小鼠用于與野生型小鼠連續(xù)繁殖以建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系。2、分別選取健康雄性小鼠8-10周齡,分三組:野生型C57BL/6J小鼠組(WT)(n=5),野生型C57BL/6J小鼠接受DOCA-鹽聯(lián)合Ang II處理組(WT/DOCA+Ang II)(n=5),Ap N轉(zhuǎn)基因型小鼠接受DOCA-鹽聯(lián)合Ang II處理組(Ap N-Tg/DOCA+Ang II)(n=5),三組小鼠實(shí)驗(yàn)開始前1周均接受單腎切除,第0天,WT/DOCA+Ang II組和Ap N-Tg/DOCA+Ang II組小鼠皮下置入Ang II微量泵,速度為1.0ng/min/g和25mg DOCA藥片,及1%氯化鈉飲水共3周。同時(shí)予0.15%吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol,I3C)的食物飲食,每周行24小時(shí)代謝籠試驗(yàn),共3周,監(jiān)測(cè)體重,血壓,飲水量,尿量,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量。3、Western blot檢測(cè)Ap N在不同劑量I3C誘導(dǎo)的人源性全長Ap N轉(zhuǎn)基因小鼠血清,肝臟,脂肪組織中的表達(dá)。檢測(cè)不同組小鼠腎皮質(zhì)纖維化指標(biāo)PAI-1,FN,α-SMA,炎癥指標(biāo)NF-κB-p65,p ERK1/2,氧化應(yīng)激指標(biāo)NOX2,p47phox和足細(xì)胞損傷指標(biāo)B7-1的變化。4、Real-time RT-PCR法檢測(cè)不同組小鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1,FN,COL I,COL IV,megalin,cubilin,KIM-1和NGAL的表達(dá)。5、免疫熒光法檢測(cè)不同組小鼠腎臟皮質(zhì)Ap N,FN,podocin,nephrin,WT-1,Ki-67,F4/80的沉積。6、過碘酸雪夫染色(periodic acid-shiff’s reaction,PAS)檢測(cè)不同組小鼠腎小球系膜區(qū)ECM增生改變。7、Masson’s Trichrome染色檢測(cè)不同組小鼠腎小管間質(zhì)纖維化。8、電鏡觀察不同組小鼠足細(xì)胞改變。結(jié)果:1、成功構(gòu)建可誘導(dǎo)型人源性全長Ap N肝臟組織特異性表達(dá)載體p BSskplus-cyp1a1-human Ap N;建立穩(wěn)定的可誘導(dǎo)型人源性全長Ap N轉(zhuǎn)基因鼠系。2、WT,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II三組小鼠體重?zé)o顯著性差異;與WT組比較,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組血壓,24小時(shí)飲水量,尿量,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量均顯著性升高;與WT/DOCA+Ang II比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組血壓,飲水量,尿量無顯著性變化;與WT/DOCA+Ang II比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量均顯著性下降。3、Western blot結(jié)果顯示,3.1、與WT+0.3%I3C組比較,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C兩組Ap N在肝臟組織中表達(dá)顯著性增強(qiáng),與Ap N-Tg+0.15%I3C組比較,Ap N-Tg+0.3%I3C組Ap N在肝臟組織中表達(dá)無顯著性差異;3.2、與WT+0.3%I3C組比較,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C兩組Ap N在血清中表達(dá)顯著性增強(qiáng),與Ap N-Tg+0.15%I3C組比較,Ap N-Tg+0.3%I3C組Ap N在血清中表達(dá)顯著性增強(qiáng);3.3、WT+0.3%I3C組,Ap N-Tg+0.15%I3C,Ap N-Tg+0.3%I3C三組Ap N在脂肪組織中表達(dá)無顯著性差異;3.4、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組Ap N在血清中表達(dá)無顯著性變化,與WT組和WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組Ap N在血清組織中表達(dá)顯著性增強(qiáng);3.5、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組腎臟皮質(zhì)組織中PAI-1,FN,α-SMA,B7-1,p NF-κB-p65,NOX2,p47phox,p ERK1/2蛋白表達(dá)顯著性增強(qiáng),與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎臟皮質(zhì)組織中PAI-1,FN,α-SMA,B7-1,p-NF-κB-p65,NOX2,p47phox,p ERK1/2蛋白表達(dá)顯著性降低,與WT組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎臟皮質(zhì)組織中PAI-1,B7-1,p NF-κB-p65顯著性降低,FN,α-SMA,NOX2,p ERK1/2顯著性升高,p47phox蛋白表達(dá)無顯著性變化;3.6、與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組小鼠尿白蛋白顯著性降低;4、Real-time RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,4.1、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II和Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組腎臟皮質(zhì)組織中TGF-β1,FN,Col I,Col IV,KIM-1,NGAL m RNA的表達(dá)顯著性增強(qiáng),與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎臟皮質(zhì)組織中TGF-β1,FN,Col I,Col IV,KIM-1,NGAL m RNA的表達(dá)顯著性降低;4.2、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組腎臟皮質(zhì)組織中cubilin和megalin m RNA的表達(dá)顯著性降低,與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎臟皮質(zhì)組織中cubilin和megalin m RNA的表達(dá)顯著性升高;5、組織免疫熒光結(jié)果顯示,5.1、與WT/DOCA+Ang II組相比,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組中腎小球組織中可見Ap N沉積;5.2、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中FN表達(dá)顯著性增強(qiáng),與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中FN表達(dá)顯著性降低,與WT組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中FN表達(dá)無顯著性變化;5.3、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中nephrin,podocin,WT-1表達(dá)顯著性降低,與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中nephrin,podocin,WT-1表達(dá)顯著性增加,與WT組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球結(jié)構(gòu)中nephrin,podocin,WT-1表達(dá)無顯著性變化;5.4、與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎組織中Ki67,F4/80表達(dá)顯著性增強(qiáng),與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎組織結(jié)構(gòu)中Ki67,F4/80表達(dá)顯著性降低;6、PAS結(jié)果顯示,與WT組比較,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組腎小球系膜基質(zhì)評(píng)分顯著性增加,與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球系膜基質(zhì)評(píng)分顯著性降低。7、Masson’s Trichrome染色顯示,與WT組比較,WT/DOCA+Ang II,Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分顯著性增加,與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分顯著性降低。8、電鏡結(jié)果顯示,與WT組比較,WT/DOCA+Ang II組腎小球足細(xì)胞融合,脫落,與WT/DOCA+Ang II組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II組腎小球足細(xì)胞融合,脫落明顯緩解。與WT組比較,Ap N-Tg/DOCA+Ang II兩組腎小球足細(xì)胞無顯著性改變。結(jié)論:1、建立可誘導(dǎo)型人源性全長Ap N轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。在轉(zhuǎn)基因小鼠中,Ap N在肝臟表達(dá),分泌入血,到達(dá)腎臟發(fā)揮作用,不影響脂肪組織表達(dá)。2、成功建立DOCA-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷模型,Ap N緩解DOCA-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)的尿白蛋白,尿白蛋白/肌酐,尿白蛋白排泄量,但對(duì)血壓,體重,尿量及飲水量無影響。3、Ap N改善DOCA-鹽聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)小鼠腎臟纖維化,足細(xì)胞損傷,氧化應(yīng)激,及炎癥因子指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

ApN肝臟組織特異性表達(dá)載體pBSskplus-cyp1a1-humanApN

14圖 2 BssH II/Not I 酶切鑒定 pBSskplus-cyp1a1-human Aarker，圖中 2 代表 pBSskplus-cyp1a1-human ApN 的質(zhì)粒，pBSskplus-cyp1a1-human ApN 的質(zhì)粒。圖 3 cDNA 融合基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

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