【摘要】：研究背景心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)尤其是終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)患者死亡的最常見原因。血管鈣化(vascular calcification,VC)是預測心血管和全因死亡率的一個強有力的因素。傳統(tǒng)上認為,鈣-磷穩(wěn)態(tài)失衡是ESRD患者血管鈣鹽沉積的主要原因,高鈣和高磷血癥可以促進血管平滑肌細胞轉化為成骨樣細胞從而在血管鈣化中發(fā)揮重要作用。然而,即使有效控制鈣磷水平,慢性腎衰竭患者VC的發(fā)生和進展仍然高于普通人群,這表明ESRD中存在一些其他因素可能參與血管鈣化的發(fā)生。草酸是ESRD患者潴留的尿毒癥毒素之一,目前體內、體外實驗均有研究證明高草酸血癥與心血管功能密切相關。冠脈粥樣硬化患者的尸檢病例中發(fā)現(xiàn)其硬化血管斑塊中存在草酸鹽沉積。氧化應激在血管鈣化的病理生理過程中發(fā)揮了重要的作用,高草酸可以引起腎小管上皮細胞氧化應激增強引發(fā)細胞的繼發(fā)性損傷,我們推測隨著腎功能衰竭引起的高草酸血癥可能也與CKD的氧化應激狀態(tài)相關從而影響血管鈣化的進展。研究目的本研究的主要目的是探究高草酸血癥在尿毒癥血管鈣化中的作用及其激活氧化應激反應參與血管鈣化的相關性,以及探究產甲酸草酸桿菌的降草酸治療是否可以改善尿毒癥的氧化應激狀態(tài)和血管鈣化的進展。研究方法收集20例CKD3-5期患者,按照性別、年齡匹配20例腎功能正常的患者作為對照組。收集血清監(jiān)測血草酸濃度及晚期氧化蛋白產物(Advanced oxidation protein product,AOPP),并探究其相關性。收集ESRD患者動脈組織,采用離子色譜法檢測血管草酸鹽和磷酸鹽含量。體外實驗探究不同濃度的草酸對血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的作用及機制。內皮細胞和平滑肌細胞在不同濃度的草酸刺激后收集細胞的上清用ELISA檢測血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、TNF-а、IL-6、CRP、AOPP的表達,觀察草酸是否會促進細胞的氧化應激及炎癥因子的分泌。通過Realtime-PCR和Western-blot檢測runt相關的轉錄因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等成骨轉錄因子的表達,觀察平滑肌細胞在高草酸的刺激下是否可以向成骨樣細胞轉化及具體的機制。體內實驗采用apoE~(-/-)的小鼠行左腎摘除+右腎電凝術,建立加速性動脈鈣化的尿毒癥模型。具體分組:對照組、尿毒癥模型組。每四周收集小鼠24小時尿液,采用離子色譜法檢測尿草酸鹽排泄量。于造模12周處死動物,收集各組血液標本。采用自動生化分析儀檢測血尿素、血草酸、血鈣、血磷、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯,離子色譜法檢測血草酸濃度,ELISA法檢測MDA、SOD、AOPP、TNF-а、IL-6等。分離主動脈,采用Von Kossa染色評價血管鈣化情況,通過半定量的方法比較兩組鈣化斑塊的面積大小;同時采用離子色譜法對血管的草酸鹽與磷酸鹽的含量進行定量檢測。隨后采用產甲酸草酸桿菌(Oxalobacter formigenes,OxF)治療降低造模組小鼠血草酸水平,于干預12周后處死動物,觀察OxF干預后血尿草酸、血清氧化應激指標、血管鈣化及血管草酸鹽含量的變化。研究結果臨床研究結果發(fā)現(xiàn)CKD3期患者血草酸濃度為對照組的3倍左右,CKD4-5期患者血草酸濃度為對照組的5倍左右,血草酸濃度與肌酐、AOPP濃度呈正相關,ESRD患者腎動脈中檢測到草酸鹽含量4.89±2.12ug/g,血草酸濃度與血管草酸鹽含量存在呈正相關,r=0.78,但P0.05,可能為血管數量太少所致。血管內皮細胞在高草酸(200μM和500μM)刺激24小時后,用Elisa檢測細胞上清的MDA、TNF-а、IL-6、CRP、AOPP顯著升高,SOD活力顯著降低,這一結果與Real-time PCR的結果相一致,但平滑肌細胞氧化應激指標沒有明顯的改變,western-blot結果顯示高濃度的草酸可激活Jak2/Stat3信號通路,這表明高草酸可以激活Jak2/Stat3信號通路促進內皮細胞的氧化應激和炎癥因子的分泌,平滑肌細胞在高草酸刺激下,RUNX2、ALP等成骨轉錄因子表達顯著升高,伴有Erk 1/2信號通路的激活。體內實驗發(fā)現(xiàn)尿毒癥組血尿素、草酸、血磷、低密度脂蛋白、總膽固醇及血清的氧化應激指標AOPP、MDA顯著高于對照組,SOD活力顯著低于對照組。此外,尿毒癥組鈣化斑塊顯著高于對照組,且血清鈣、磷、鈣磷乘積及血草酸濃度均與鈣化斑塊面積成正相關,相關系數r分別為0.67,0.56,0.50,0.53,P均小于0.05。離子色譜法檢測發(fā)現(xiàn)對照組和尿毒癥組小鼠的鈣化血管中均檢測到草酸鹽,但尿毒癥組草酸鹽的含量顯著高于對照組(尿毒癥組草酸鹽含量為24.96±7.59ug/g,草酸鹽與磷酸鹽的比值為1:282,對照組草酸鹽含量為2.64±0.54ug/g,草酸鹽與磷酸鹽的比值為1:415),提示相比單純的血管鈣化,慢性腎衰竭中草酸對血管鈣化的貢獻明顯增加。此外,血清草酸水平與血管的磷酸鹽及草酸鹽的定量成正相關,相關系數r分別為0.77,0.59,P均小于0.05,血草酸濃度與MDA、AOPP、IL-6成正相關,相關系數r分別為0.70,0.52,0.53,與SOD活力成負相關,r=-0.53,P0.05。產甲酸草酸桿菌干預12周后,小鼠糞便中產甲酸草酸桿菌的濃度維持在10~6cfu/g,OxF干預后血草酸、MDA、AOPP、TNF-а均顯著下降,SOD顯著升高。Von Kossa染色半定量分析結果顯示CKD+OxF干預組的血管鈣化面積較CKD組減少但差異沒有統(tǒng)計學意義,CKD+OxF干預組血管草酸鹽含量較CKD組顯著降低,P0.05。結論本研究結果顯示,CKD患者血草酸濃度與血肌酐、氧化應激產物濃度成正相關,ESRD患者的血管壁除了磷酸鹽還有少部分草酸鹽的沉積,為了進一步證實血草酸濃度與血管草酸鹽含量的相關性需進一步擴大血管的樣本數量。體外實驗中顯示高草酸可促進血管內皮細胞的氧化應激和炎癥因子的分泌,進一步證實了高草酸與氧化應激的相關性,且高草酸可以促進平滑肌細胞成骨樣轉錄因子表達升高從而促進血管鈣化進展。動物實驗中,CKD和對照組鈣化血管中均檢測到草酸鹽,CKD組血草酸濃度和血管草酸鹽含量明顯高于對照組,血草酸濃度與氧化應激指標、血管草酸鹽與磷酸鹽的定量成正相關,產甲酸草酸桿菌的干預降低了血草酸濃度和血管壁草酸鹽的含量,并且改善了CKD的氧化應激狀態(tài)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692.5
【圖文】：

L） 78.85±8.33 167.20±29.42**692.90±106.47**<0.0001 1.26±0.23 1.47±0.37 1.98±0.41*0.0004 2.36±0.45 2.42±0.38 2.46±0.22 0.50 鈣2.91±0.65 3.34±0.42 4.88±1.10**0.0003 143.10±23.10 343.40±64.71**549.50±118.70**<0.0001 114.70±4.83 109.30±6.34*92.90±9.47**<0.0001 L） 2.88±0.99 10.69±4.76**18.54±5.98**<0.0001 組相比，*p<0.05，**P<0.001KD3 期血草酸濃度約是對照組的 3 倍，P=0.0001， t=6.78；CKD4-5 期是對照組的 5 倍，P<0.0001，t=11.02，且血草酸濃度與血肌酐濃度成正相P<0.0001，見圖 1-3。

軍軍醫(yī)大學碩士學位論文（三）慢性腎衰竭高草酸血癥與血管鈣化的相關性ESRD 患者血管中可以檢測到草酸鹽（圖 1-4 中離子色譜法可看到草酸鹽特定），且草酸鹽含量為 4.89±2.12 ug/g，磷酸鹽含量為 1656.12±387.70 ug/g，血清草量與動脈草酸鹽含量成正相關，r=0.78, 但 P=0.12>0.05，見圖 1-4。

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