【摘要】：目的:PLCε(Phospholipase Cε)是一種癌基因,在激素敏感性前列腺癌中高表達(dá),Hedgehog/Gli信號(hào)通路在前列腺癌(Prostate cancer,PCa)組織中存在過度激活的現(xiàn)象,前期研究結(jié)果提示,在PCa中PLCε以及Hedgehog信號(hào)通路均參與雄激素受體(Androgen receptor,AR)的調(diào)節(jié),但PLCε、Hedgehog/Gli在去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)中的作用尚不清楚。本研究的目的是探討PLCε、Hedgehog/Gli與AR在CRPC中的相互作用關(guān)系以及作用機(jī)制,以及在CRPC細(xì)胞中敲低PLCε是否通過調(diào)節(jié)AR活性來影響其對(duì)恩雜魯胺的藥物敏感性。方法:1)收集2010年1月至2015年8月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)組織標(biāo)本30例,前列腺癌(PCa)組織標(biāo)本64例,以及CRPC石蠟切片和組織標(biāo)本(共27例)。使用免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測PLCε和Gli-1、Gli-2的蛋白表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析PLCε、Gli-1和Gli-2在BPH、PCa以及CRPC組織中的表達(dá)差異及相關(guān)性,并分析PLCε在CRPC組織中的表達(dá)情況與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系,進(jìn)一步分析CRPC患者生存率(overall survival,OS)和無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)。2)使用LNCaP、22RV1、EN-R三個(gè)細(xì)胞株,(22RV1、EN-R代表CRPC細(xì)胞)Western blot及RT-qPCR方法檢測三株細(xì)胞中PLCε蛋白及mRNA水平的表達(dá)。使用慢病毒載體LV-shPLCε轉(zhuǎn)染LNCaP、22RV1、EN-R細(xì)胞以敲低PLCε,用克隆形成實(shí)驗(yàn)以及CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力;Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的侵襲能力。并根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)計(jì)算各株細(xì)胞在不同處理組中恩雜魯胺的IC50值,從而評(píng)估各株細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的敏感性。3)使用22RV1、EN-R兩個(gè)細(xì)胞株,慢病毒載體LV-shPLCε敲低PLCε,以及單獨(dú)或聯(lián)合使用Hedgehog/Gli信號(hào)通路抑制劑GANT61處理,Western blot及RT-qPCR方法檢測兩株細(xì)胞中PLCε、Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)分子、AR等蛋白及mRNA水平的表達(dá)。4)敲低PLCε或/和過表達(dá)Gli-1/Gli-2處理EN-R細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測AR蛋白的核、漿表達(dá)情況差異;Western blot及RT-qPCR分別檢測EN-R細(xì)胞株中PLCε、Gli-1、Gli-2、AR、PSA、STAT3以及磷酸酸化STAT3的蛋白及mRNA表達(dá)水平,并統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)差異。5)4周齡的裸鼠分別于皮下接種2x10~6個(gè)EN-R(cont組)細(xì)胞或LV-shPLCεEN-R(LV-shPLCε組)細(xì)胞,然后每組小鼠再分成兩組,分別予以10mg/kg PBS或恩雜魯胺喂養(yǎng),32天后處死小鼠,計(jì)算瘤體體積,繪制腫瘤生長曲線。結(jié)果:1)與良性前列腺增生組織相比,PLCε、Gli-1及Gli-2在大多數(shù)PCa以及CRPC組織中的表達(dá)明顯增加,而且PLCε(P=0.0447)、Gli-1(p=0.0152)在CRPC組織中的表達(dá)與其在PCa組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Gli-2在PCa及CRPC組織中的表達(dá)中無顯著性差異(p=0.0585)。在CRPC組織中,PLCε的表達(dá)與Gli-1(r=0.586,p=0.01)及Gli-2(r=0.409,p=0.034)的表達(dá)均呈正相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示,在CRPC組織中,PLCε表達(dá)陽性的患者(PFS=24個(gè)月)與PLCε表達(dá)陰性的患者(PFS=28個(gè)月)之間的中位無進(jìn)展生存期具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.025)。在PCa組織中,PLCε表達(dá)陽性的患者(OS=61個(gè)月)與PLCε表達(dá)陰性的患者(OS=68個(gè)月)之間的總體生存期也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.027)。2)PLCε在LNCaP、22RV1、EN-R細(xì)胞中均高表達(dá),與LNCaP細(xì)胞相比較,它在22RV1及EN-R細(xì)胞中的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Gli-1及Gli-2在LNCaP細(xì)胞中低表達(dá),但在22RV1及EN-R細(xì)胞中均高表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-shPLCε或/和GANT61處理均顯著地抑制22RV1、EN-R細(xì)胞的活性�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)顯示LV-shPLCε或/和GANT61能夠抑制CRPC細(xì)胞的增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-shPLCε或/和GANT61抑制CRPC細(xì)胞的侵襲能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LV-shPLCε或/和GANT61增加了CRPC細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的敏感性。3)在22RV1及EN-R細(xì)胞中敲低PLCε抑制了Gli-1/Gli-2以及AR的mRNA和蛋白表達(dá)水平,反之抑制Gli-1/Gli-2的表達(dá)并不影響PLCε的表達(dá),提示PLCε是Gli-1/Gli-2的上游調(diào)節(jié)因子。然而,在PLCε敲低后,Smo(經(jīng)典Hh信號(hào)通路中Gli的上游調(diào)控基因)沒有表現(xiàn)出顯著的mRNA和蛋白表達(dá)變化。提示PLCε通過非經(jīng)典的Hh/Gli信號(hào)途徑影響Gli-1/Gli-2的表達(dá)。4)敲低PLCε或/和過表達(dá)Gli-1/Gli-2處理EN-R細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示敲低PLCε通過Gli-2/AR信號(hào)途徑來抑制AR的核轉(zhuǎn)位,Western blot及RT-qPCR結(jié)果顯示敲低PLCε通過p-STAT3信號(hào)途徑來影響AR的靶基因PSA的表達(dá)。5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低PLCε抑制了去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞皮下移植瘤的生長并增加了CRPC細(xì)胞移植瘤對(duì)恩雜魯胺的藥物敏感性。結(jié)論:1.PLCε陽性表達(dá)預(yù)示CRPC患者較差的臨床預(yù)后。2.抑制PLCε的表達(dá)可以抑制CRPC細(xì)胞的增殖以及侵襲能力。3.PLCε通過非經(jīng)典的Hh/Gli信號(hào)途徑以及p-STAT3信號(hào)途徑調(diào)節(jié)AR的活性,從而增加了去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的藥物敏感性。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

BPH、PCa與CRPC組織中PLCε、Gli-1和Gli-2的免疫組化染色Figure1.1ImmunohistochemicalstainingofPLCε、Gli-1andGli-2inBPH,PCaandCRPCtissues

接下來我們用Spearman’s 相關(guān)性分析方法分析了CRPC組織中PLCε的高表達(dá)與 Gli-1、Gli-2 的上調(diào)是否具有相關(guān)性。結(jié)果顯示，在 CRPC 組織中，PLCε的高表達(dá)與 Gli-1 的表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān)（r=0.586, p=0.01），而且，PLCε的高表達(dá)與 Gli-2的表達(dá)上調(diào)也呈正相關(guān)（r=0.409, p=0.034）（圖 1.3）。

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1 馬建宏;曹開源;徐霖;鐘慧玲;張素粉;羅虹嬌;庹玖玲;張?zhí)?劉建中;;前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年11期

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本文編號(hào)：2738390