【摘要】：研究背景和目的卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中致命率最高。PARP抑制劑是新型抗腫瘤藥,適用于BRCA基因突變患者。隨訪發(fā)現(xiàn)幾乎所有患者最終產(chǎn)生耐藥和腫瘤進(jìn)展。明確耐藥機(jī)制并克服,提高PARP抑制劑治療效果成為卵巢癌研究熱點(diǎn)。乙醛脫氫酶(ALDH)活性常與腫瘤多重耐藥性相關(guān),目前尚未有研究明確ALDH是否也參與介導(dǎo)卵巢腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑的耐藥性。本課題通過研究ALDH家族中ALDH1A1基因是否參與介導(dǎo)PARP抑制劑耐藥性及可能機(jī)制,探討逆轉(zhuǎn)耐藥可能性,為發(fā)現(xiàn)臨床耐藥卵巢腫瘤治療新靶點(diǎn)提供線索及思路。研究方法1.BRCA2-/-PARP抑制劑耐藥細(xì)胞的構(gòu)建及驗(yàn)證;2.流式細(xì)胞儀檢測耐藥株與親本細(xì)胞ALDH酶活性差別;3.亞甲藍(lán)細(xì)胞染色法檢測ALDH酶活性與PARP抑制劑耐藥性關(guān)系;4.RT-PCR檢測ALDH家族各基因表達(dá)選定靶基因ALDH1A1,分別用質(zhì)粒、siRNA調(diào)控ALDH1A1,檢測對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響;5.免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測PARP抑制劑對(duì)ALDH1A1上游蛋白BRD4的作用及調(diào)控BRD4對(duì)ALDH1A1的功能學(xué)影響;6.上調(diào)三種DNA損傷修復(fù)通路指示細(xì)胞ALDH1A1表達(dá)并用流式細(xì)胞術(shù)測定其通路活性改變;7.亞甲藍(lán)染色法測定ALDH1A1靶向抑制劑是否能逆轉(zhuǎn)PARP抑制劑耐藥性。8.小鼠體內(nèi)荷瘤模型對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果1.篩選出對(duì)PARP抑制劑穩(wěn)定耐藥的PEO1-R,Kura-R細(xì)胞;2.耐藥株ALDH酶活性明顯較親本細(xì)胞高(P0.01),且升高是PARP抑制劑直接誘導(dǎo)導(dǎo)致的;3.ALDH酶活性升高,細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑的耐受性升高(P0.01)4.RT-PCR提示ALDH1A1為主要作用基因,過表達(dá)ALDH1A1細(xì)胞耐藥性升高(P0.01),同樣下調(diào)ALDH1A1則細(xì)胞敏感性升高(P0.01);5.PARP抑制劑可以正向調(diào)控BRD4;若抑制BRD4功能,ALDH1A1不再受PARP抑制劑誘導(dǎo);6.過表達(dá)ALDH1A1,細(xì)胞DNA修復(fù)能力明顯增強(qiáng),且同源重組途徑或非同源末端連接途徑活性無顯著性差異(P0.05),只有微同源末端連接途徑明顯增強(qiáng)(P0.01);7.聯(lián)合應(yīng)用PARP抑制劑奧拉帕尼及ALDH1A1特異性抑制劑后,在BRCA2野生型細(xì)胞中細(xì)胞存活率差異較單藥組無顯著性差異(P0.05),而在BRCA2-/-細(xì)胞中可見顯著藥物協(xié)同作用(P0.01)。8.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣顯示聯(lián)合用藥組對(duì)腫瘤殺傷作用最明顯(P0.01)。研究結(jié)論1.PARP抑制劑本身可誘導(dǎo)ALDH1A1表達(dá)的增強(qiáng),從而導(dǎo)致ALDH酶活性的增強(qiáng);2.這種誘導(dǎo)是通過正向調(diào)控BRD4達(dá)成的;3.ALDH1A1在BRCA2-/-的卵巢腫瘤細(xì)胞內(nèi),可通過增強(qiáng)其微同源末端連接修復(fù)能力促進(jìn)其修復(fù)DNA損傷,從而產(chǎn)生藥物耐受性;4.當(dāng)我們使用選擇性ALDH1A1抑制劑時(shí),原耐藥細(xì)胞可恢復(fù)對(duì)PARP抑制劑的敏感性;綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們:ALDH1A1通過影響細(xì)胞DNA修復(fù)能力介導(dǎo)BRCA2-/-卵巢癌患者對(duì)PARP抑制劑耐受,若我們靶向抑制ALDH1A1可能逆轉(zhuǎn)這一耐藥性,這一機(jī)制可為ALDH1A1成為臨床治療新靶點(diǎn)之一提供線索,但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.11
【圖文】：

第二章奧拉帕尼耐藥細(xì)胞株的篩選構(gòu)建表２－３耐藥株與敏感株細(xì)胞Ｎｉｒａｐａｒｉｂ邋ＩＣ５０比較逡逑Ｔａｂｌｅ２－１邋ＩＣ５０邋ｔｏ邋Ｎｉｒａｐａｒｉｂ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅｓ逡逑ｅ邐Ｍｅａｎ±ＳＤ邐Ｆ，Ｐ逡逑（０．９７±０．０１）＾Ｍ邐Ｆ＝１．８５６，邋Ｐ＝０．０００逡逑－Ｒ邐（１．８０±０．０２）＾Ｍ逡逑ｏｃｈｉ邐（０．０６±０．００）＾Ｍ邐Ｆ＝２７．８３３，邋Ｐ＝０．０００逡逑Ｒ邐（１．６７±０．０３）＾Ｍ逡逑Ａ邐—ＰＥＯＩ逡逑１２０邐－－——

逡逑結(jié)果顯示兩種耐藥細(xì)胞的ＡＬＤＨ？細(xì)胞百分比均明顯高于親本細(xì)胞（圖３－１Ａ，逡逑表３－１）邋：邐Ｋｕｍ－Ｒ和Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ細(xì)胞ＡＬＤＨ強(qiáng)細(xì)胞百分比分別為１５．８６％±３．８１０／0逡逑和邋３．５６％±０．４２％，數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｔ＝１１．９１２，Ｐ＝０．０００）；邋ＰＥＯｌ－Ｒ邋和邋ＰＥ０１逡逑分別為９．８３％±０．６４％和０．３７％±０．１５％，數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｔ＝２０．２００，逡逑Ｐ＝０．０００）；兩組數(shù)據(jù)均提示耐藥細(xì)胞內(nèi)ＡＬＤＨ酶活性增高。逡逑同時(shí)，我們給予親本細(xì)胞短期（７天）安慰劑或奧拉帕尼處理，同樣發(fā)現(xiàn)奧逡逑拉帕尼處理組細(xì)胞的ＡＬＤＨ？細(xì)胞百分比增高（圖３－１邋Ｂ，表３－２）：邋Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ為逡逑２３．５５％±１．３２％對(duì)比安慰劑組邋３．３３％±０．２５３％邋（ｔ＝９．０８９，邋Ｐ＝０．００１）邋，邋ＰＥＯｌ邋為逡逑５．８７％±０．６４°／。對(duì)比安慰劑組邋０．１６％±０．０３％邋（ｔ＝１０．４４８，Ｐ＝０．００１），兩組數(shù)據(jù)均有顯逡逑著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示細(xì)胞酶活性增強(qiáng)。逡逑表３－１耐藥株與敏感株細(xì)胞ＡＬＤＨ？細(xì)胞比例比較逡逑Ｔａｂｌｅ２－１邋ＡＬＤＨ＾邋ｃｅｌｔｓ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ邋ｐａｒｅｎｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｃｅｌｌ邋ｌｉｎｅ邐Ｍｅａｎ邋土邋ＳＤ邐ｔ

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本文編號(hào)：2731736