【摘要】：目的:檢測(cè)CIRBP和Sam68在小鼠睪丸組織和小鼠體外初級(jí)精母細(xì)胞中的表達(dá)變化,并初步探索CIRBP誘導(dǎo)初級(jí)精母細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制。方法:(1)動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn),將成年雄性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、熱激后3h組和熱激后12h組。對(duì)照組無(wú)任何處理,熱激組小鼠模型構(gòu)建,在水浴鍋中給予43℃小鼠陰囊短暫熱激處理一次(30min),分別于熱激后3h、12h取出其睪丸組織,待進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);(2)細(xì)胞熱激實(shí)驗(yàn),將小鼠初級(jí)精母細(xì)胞GC-2spd分為對(duì)照組、熱激30min組、熱激60min組;對(duì)照組無(wú)任何干預(yù)措施,熱激組細(xì)胞模型構(gòu)建,將細(xì)胞置于43℃恒溫箱中分別孵育30min、60min,繼續(xù)培養(yǎng)48h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。(3)細(xì)胞RNA干擾實(shí)驗(yàn),構(gòu)建GC-2spd細(xì)胞CIRBP基因低表達(dá)模型,設(shè)定為對(duì)照組、10n M-si RNA組、20n M-si RNA組、30n M-si RNA組、50n M-si RNA組,轉(zhuǎn)染后12h、24h和48h,提取細(xì)胞樣本。q RT-PCR檢測(cè)CIRBP、Sam68 m RNA的表達(dá)變化;Western blot檢測(cè)CIRBP、Sam68、ERK1/2、p ERK1/2蛋白的表達(dá)水平;并運(yùn)用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)法對(duì)GC-2spd細(xì)胞進(jìn)行凋亡水平檢測(cè)。結(jié)果:(1)小鼠睪丸組織熱激后3h和12h,發(fā)現(xiàn)CIRBP和Sam68的m RNA和蛋白水平在熱激后是明顯下降的(p0.05),且隨著熱激后時(shí)間的延長(zhǎng),CIRBP的表達(dá)是逐漸下降的。(2)小鼠睪丸組織熱激后3h和12h,發(fā)現(xiàn)ERK1/2蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的變化,p-ERK1/2蛋白在熱激后是明顯降低的,與對(duì)照組比較,在熱激后12h具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)GC-2spd細(xì)胞熱激30min組和熱激60min組,結(jié)果顯示CIRBP和Sam68的m RNA表達(dá)在熱激后12h無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);熱激后24h,與對(duì)照組比較,CIRBP和Sam68的m RNA在熱激60min組的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);熱激后48h,與對(duì)照組比較,CIRBP和Sam68的m RNA在熱激30min組和熱激60min組的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。熱激后48h,CIRBP和Sam68的蛋白水平在熱激30min組和熱激60min組的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(4)在細(xì)胞干擾模型中,CIRBP隨著si RNA濃度的增加,其m RNA和蛋白的表達(dá)是明顯降低的(p0.05);Sam68 m RNA的表達(dá)僅在轉(zhuǎn)染后48h,si RNA濃度為50n M時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),Sam68蛋白在轉(zhuǎn)染后沒(méi)有明顯的變化;ERK1/2蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有變化;p ERK1/2蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染后呈下降趨勢(shì),但僅在轉(zhuǎn)染濃度為50n M組時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:熱激后CIRBP可能通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)Sam68的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá),啟動(dòng)下游機(jī)制誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡。此外,在熱激時(shí),CIRBP還可能通過(guò)調(diào)控ERK1/2的活化與磷酸化,進(jìn)而可能啟動(dòng)Ras/Raf/MEK/ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)通路,調(diào)控生精細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R698.2
【圖文】：

中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論織和 GC-2spd 細(xì)胞中 CIRBP、Sam68 mRNA 的表達(dá)IRBP、Sam68 mRNA 的表達(dá)見(jiàn)圖 1-1。電泳結(jié)果顯示，CIRBn 在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、睪丸、子宮、卵程度的表達(dá)。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文二、小鼠睪丸組織熱激前后 mRNA 和蛋白的表達(dá)變化1. PCR 結(jié)果① 小鼠睪丸組織 CIRBP、Sam68 及β-actin 基因 PCR 的擴(kuò)增曲線及溶解曲線如圖及圖 2-2 所示，qRT-PCR 溶解曲線分析可見(jiàn) PCR 產(chǎn)物表現(xiàn)為單一、高聳的單峰，未見(jiàn)特異性擴(kuò)增。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊琨;張倩;潘陽(yáng)陽(yáng);余四九;何俊峰;崔燕;;冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白基因(CIRP)在牦牛睪丸不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)和定位研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2015年09期

本文編號(hào)：2732443