【摘要】：目的:1.觀察pannexin1通道蛋白在睪丸細(xì)胞中的表達(dá)。2.明確pannexin1通道對(duì)睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移的作用及可能機(jī)制。方法:1.Western blotting法檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3和睪丸癌I-10細(xì)胞中pannexin1蛋白表達(dá)。2.Pannexin1通道抑制劑甘珀酸(CBX)和丙磺舒(PBN)作用睪丸癌I-10細(xì)胞后,使用實(shí)時(shí)熒光傳遞法和細(xì)胞外ATP檢測(cè)法檢測(cè)CBX和PBN對(duì)pannexin1通道功能的抑制作用;transwell法和細(xì)胞劃痕法檢測(cè)CBX和PBN對(duì)睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用;western blotting法檢測(cè)侵襲遷移相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表達(dá)。3.分子生物學(xué)沉默(sh RNA)和過(guò)表達(dá)pannexin1(m Panx-1)后,使用實(shí)時(shí)熒光傳遞法和細(xì)胞外ATP檢測(cè)法檢測(cè)sh RNA和m Panx-1分別抑制和增強(qiáng)pannexin1通道功能;transwell法和細(xì)胞劃痕法檢測(cè)sh RNA對(duì)睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用和m Panx-1增強(qiáng)睪丸癌I-10侵襲遷移能力;western blotting法檢測(cè)侵襲遷移相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表達(dá)。4.在sh RNA和m Panx-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中,使用U0126(p-ERK抑制劑)抑制p-ERK的表達(dá)后,transwell法和細(xì)胞劃痕法檢測(cè)U0126對(duì)sh RNA和m Panx-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用;western blotting法檢測(cè)侵襲遷移相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin和MM-9的表達(dá)。結(jié)果:1.與睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3相比,睪丸癌細(xì)胞中pannexin1蛋白表達(dá)量顯著增多。Western blotting結(jié)果顯示,相比睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3,睪丸癌細(xì)胞Tcam-2、MLTC-1以及I-10中pannexin1表達(dá)量明顯增高(P0.05)。2.CBX和PBN抑制pannexin1通道后,pannexin1通道功能下降。實(shí)時(shí)熒光傳遞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與control組相比,使用pannexin1通道抑制劑CBX和PBN后,細(xì)胞熒光傳遞能力明顯下降(熒光傳遞強(qiáng)度反應(yīng)pannexin1通道強(qiáng)弱)(P0.05);細(xì)胞外ATP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞外ATP水平高,pannexin1通道功能強(qiáng))發(fā)現(xiàn),與control組相比,使用CBX和PBN抑制pannexin1通道后,細(xì)胞外ATP含量明顯降低(P0.05)。3.CBX、PBN抑制pannexin1通道后,睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移能力下降。Transwell和劃痕結(jié)果表明:與Control組相比,CBX組和PBN組的遷移能力降低(P0.05);侵襲能力降低(P0.05)。促侵襲遷移蛋白MMP-9和vimentin表達(dá)量降低(P0.05);抑侵襲遷移蛋白E-cadherin表達(dá)量升高(P0.05)。4.沉默Panx-1可降低睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移能力。實(shí)時(shí)熒光傳遞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):沉默Panx-1基因后,睪丸癌I-10細(xì)胞中pannexin1通道功能變?nèi)?P0.05);ATP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外ATP水平降低(P0.05);transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默Panx-1后,睪丸癌細(xì)胞I-10侵襲遷移能力降低(P0.05)。Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn):促侵襲遷移蛋白MMP-9和vimentin表達(dá)量降低(P0.05);抑侵襲遷移蛋白E-cadherin表達(dá)量升高(P0.05)。5.過(guò)表達(dá)Panx-1增強(qiáng)睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移能力。實(shí)時(shí)熒光傳遞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):過(guò)表達(dá)Panx-1基因后,睪丸癌I-10細(xì)胞中pannexin1通道功能變強(qiáng)(P0.05);ATP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外ATP水平增強(qiáng)(P0.05);transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Panx-1后,睪丸癌細(xì)胞I-10侵襲遷移能力增強(qiáng)(P0.05);western blotting結(jié)果:促侵襲遷移蛋白MMP-9和vimentin表達(dá)量升高(P0.05);抑侵襲遷移蛋白E-cadherin表達(dá)量降低(P0.05)。6.在過(guò)表達(dá)Panx-1細(xì)胞株中,m Panx-1增強(qiáng)睪丸癌細(xì)胞侵襲遷移能力,U0126(p-ERK抑制劑)能顯著降低過(guò)表達(dá)株細(xì)胞侵襲遷能力。Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在過(guò)表達(dá)Panx-1基因細(xì)胞株中,與NC組和m Panx-1組相比,U0126+m Panx-1組能顯著抑制睪丸癌細(xì)胞侵襲遷移(P0.05);western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),U0126+m Panx-1能顯著抑制MMP-9和vimentin蛋白的表達(dá),增強(qiáng)E-cadherin蛋白的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.Pannexin1通道蛋白在睪丸癌I-10細(xì)胞中表達(dá)量增加。2.Pannexin1通道促進(jìn)睪丸癌I-10細(xì)胞侵襲遷移可能與增強(qiáng)p-ERK1/2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.21
【圖文】：

期間準(zhǔn)備新的離心管，并用記號(hào)筆標(biāo)記，按順序排列好放于冰盒上，待離心完后，去離心后的上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，避免蛋白污染和破壞。保存，行下一步實(shí)驗(yàn)。2.3.2 測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度2.3.2.1 根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備上樣液根據(jù) BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Tcam-2 以及睪丸癌非精原細(xì)胞 MLTC-1 和 I-10 細(xì)胞中 Panx-1 蛋白的表達(dá)。Panx-1蛋白作為 Panx 蛋白家族中表達(dá)最多的蛋白，分子量 78KDa，在細(xì)胞膜上形成一個(gè)六聚體膜蛋白通道，參與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換。在離子電壓差，機(jī)械壓力和capase 剪切下，通道打開(kāi)，釋放 ATP，IP3 等信號(hào)分子，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和侵襲遷移等。圖 2A 結(jié)果顯示，與睪丸間質(zhì)細(xì)胞 TM3 相比，睪丸癌精原細(xì)胞 Tcam-2 以及睪丸癌非精原細(xì)胞 MLTC-1 和 I-10 細(xì)胞中 Panx-1 蛋白表達(dá)顯著性增多（P<0.001）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與睪丸癌精原細(xì)胞 Tcam-2 相比，在睪丸癌非精原細(xì)胞 MLTC-1 和 I-10 中發(fā)現(xiàn)，Panx-1 蛋白表達(dá)量也明顯較高，這種結(jié)果提示，Panx-1可能參與睪丸癌的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)提示 Panx-1 在惡性程度較高的睪丸癌非精原細(xì)胞中表達(dá)增高。結(jié)合以上結(jié)果，提示我們 Panx-1 可能參與睪丸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，至于Panx-1 表達(dá)量增多的含義，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2731404