【摘要】：背景:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因之一,其確切發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。近年研究表明,糖尿病時血生化和血流動力學(xué)改變等因素所引起的自身固有免疫和炎性反應(yīng)在DN的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。固有免疫作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線,主要通過模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR)識別在進(jìn)化上高度保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)以及組織、細(xì)胞在受到損傷后所釋放的具有免疫活性調(diào)節(jié)作用的損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular pattern,DAMP),如熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)、細(xì)胞外基質(zhì)的降解產(chǎn)物、高遷移率族蛋白1(High-mobility groupboxl,HMGB1)、自身的核酸成分等。Toll 樣受體(TolJ-like receptors,TLR)是固有免疫調(diào)控系統(tǒng)的主要組成部分,糖尿病狀態(tài)下,高糖、脂質(zhì)代謝紊亂和缺氧等因素可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種內(nèi)源性配體,TLR與其相互識別即可激活固有免疫,從而誘發(fā)炎性反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化能力,可以減輕DN的發(fā)展進(jìn)程,但具體機(jī)制尚不明確。本研究通過高糖刺激足細(xì)胞,以激活TLR2和TLR4介導(dǎo)的固有免疫通路誘發(fā)炎性反應(yīng),并通過將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cordmesenchymalstemcells,HUC-MSCs)與足細(xì)胞共培養(yǎng),探究干細(xì)胞對固有免疫的影響以及對高糖狀態(tài)下足細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)控。目的:探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUC-MSCs)對高糖狀態(tài)下TLR介導(dǎo)的足細(xì)胞固有免疫反應(yīng)的影響。方法:1.從足月新生兒臍帶中提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。2.流式細(xì)胞術(shù)鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表型,應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。3.將足細(xì)胞分為3組:正常糖濃度組(NG)、甘露醇組(NG+MA)、高糖濃度組(HG),相同條件下培養(yǎng)96h,并分別在24h、48h、72h、和96h應(yīng)用CCK8測定各組足細(xì)胞的活性變化。4.將足細(xì)胞分為4組:正常糖濃度組(NG)、甘露醇組(NG+MA)、高糖濃度組(HG)、高糖濃度下足細(xì)胞與HUC-MSCs共培養(yǎng)組(HG+MSC)。刺激72h后,ELISA方法檢測各組培養(yǎng)基上清中炎性因子IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1以及TLR配體HSP70、HMGB1的表達(dá),實時定量PCR法檢測各組細(xì)胞表面及細(xì)胞提取物中TLR2、TLR4的mRNA表達(dá),Western印跡法檢測TLR2、TLR4、MyD-88 依賴型信號通路中 TLR2、TLR4、MyD-88、p-P65 的蛋白表達(dá),免疫熒光染色法觀察p-P65在足細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果:1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定:1.1流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,HUC-MSCs高表達(dá)人間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73、CD90,低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45。1.2經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后,茜素紅染色顯示細(xì)胞質(zhì)中有鈣沉積,提示HUC-MSCs已經(jīng)分化為成骨細(xì)胞;1.3成脂誘導(dǎo)分化后,行油紅O染色顯示細(xì)胞質(zhì)有紅色油滴空泡,提示HUC-MSCs已經(jīng)分化成為脂肪細(xì)胞;2.高糖刺激使足細(xì)胞活性降低并且隨刺激時間的延長其活性降低更加明顯。3.4組細(xì)胞按分組條件培養(yǎng)72h后:3.1與NG組比較,ELISA法檢測HG組炎性因子IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1表達(dá)明顯增多(均P0.05)。TLR配體HSP70、HMGB1的蛋白表達(dá)增多(均P0.05)。實時定量PCR法和蛋白印跡法檢測TLR2、TLR4的mRNA和蛋白水平增加(均P0.05),MyD-88及p-P65蛋白表達(dá)增多(均P0.05),免疫熒光染色可見p-P65核內(nèi)轉(zhuǎn)移。3.2 與 HG 組比較,HG+MSC 組炎性因子 IL-6、IL-β、TNF-α、MCP-1 以及 TLR 配體 HSP70、HMGB1 蛋白表達(dá)減少(均 P0.05),TLR2、TLR4mRNA和蛋白水平減少,MyD-88、p-P65的蛋白表達(dá)減少(均P0.05),免疫熒光染色示p-P65核內(nèi)轉(zhuǎn)移不明顯。結(jié)論:1.高糖刺激使足細(xì)胞活性降低。2.高糖刺激可使TLR介導(dǎo)的足細(xì)胞固有免疫反應(yīng)增強(qiáng)。3.HUC-MSCs共培養(yǎng)可通過抑制TLR通路,減輕免疫反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

圖２人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的表型鑒定逡逑流式細(xì)胞術(shù)檢測ＨＵＣ－ＭＳＣｓ表型，結(jié)果顯示ＨＵＣ－ＭＳＣｓ高表達(dá)ＣＤ７３邋（圖ＡＣＤ９０邋（圖Ｂ），低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物ＣＤ３４邋（圖Ｃ）、ＣＤ４５邋（圖Ｄ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋．邋Ｔｈｅ邋ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＨＵＣ－ＭＳＣｓ．邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ邋ａｎａｌｙｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈａｔ邋ＨＵＣ－ＭＳＣｓ邋ｈａｄ邋ａ邋ｈｉｇｈ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤ７３邋（Ａ），邋ＣＤ９０邋（Ｂ）邋ａｎｄ邋ｌｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤ３４邋（Ｃ），邋ＣＤ４５邋（Ｄ）．逡逑

歐＾ａｒ慧琢逡逑■，逡逑圖３人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化逡逑在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)２１天后，行茜素紅染色顯示細(xì)胞質(zhì)中有鈣沉Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋Ｔｈｅ邋ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＨＵＣ－ＭＳＣｓ．邋ＨＵＣ－ＭＳＣｓ邋ｗｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ邋ｗｈｉｌｅ邋ｔｈｅｙ邋ｗｅｒｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ｉｎｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｆｏｒ邋２１邋ｄａｙｓ邋．邋Ａｌｉｚａｒｉｎ邋ｒｅｄ邋ｓｔａｉｎ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅｒｅ邋ｗｅｒｅ邋ｃａｌｃｉｄｅｐｏｓｉｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐ邋ｌａｓｍ．逡逑＇．邐？廠．．私

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 齊文文;呂莎莎;柳剛;程靜;宋燕;明彤彤;關(guān)廣聚;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[J];中華腎臟病雜志;2014年12期

本文編號：2725000