發(fā)布時(shí)間：2020-06-21 18:39

【摘要】：前言膀胱疼痛是泌尿外科最常見(jiàn)的內(nèi)臟性疼痛,是間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征(IC/BPS)的典型表現(xiàn)。間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征是一種慢性非細(xì)菌性膀胱炎性難治性疾病,伴有下尿路癥狀(尿頻或尿急),但不伴有明顯的膀胱病理性改變。其嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,尤見(jiàn)于女性,并且隨著年齡增加,IC/BPS發(fā)病率也跟著增加。IC/BPS發(fā)病原因不十分明確,目前主要有三種觀點(diǎn):(1)膀胱上皮功能紊亂,導(dǎo)致膀胱上皮通透性或者敏感性增加;(2)膀胱及神經(jīng)性炎癥,典型的膀胱病理性表現(xiàn)為Hunner潰瘍;(3)神經(jīng)病理性疼痛,包括傳入神經(jīng)數(shù)量增多、大腦結(jié)構(gòu)和功能改變、內(nèi)源性抑制通路異常。由于發(fā)病機(jī)制不明確以及患者存在個(gè)體化差異,目前沒(méi)有治療IC/BPS的有效方案;治療主要局限于保守性治療,包括行為療法、口服或者膀胱灌注治療、膀胱水化擴(kuò)張治療,但是這些治療常常失敗或者只能短期內(nèi)改善癥狀;其余治療缺乏有效的臨床證據(jù),只能作為替代治療。現(xiàn)在大量的研究表明膀胱傳入神經(jīng)元敏感性增加與疼痛敏感性增加或者痛覺(jué)超敏感有關(guān)。支配膀胱的盆腔和下腹部/腰部?jī)?nèi)臟神經(jīng)Aδ和C-纖維不僅對(duì)機(jī)械刺激敏感,對(duì)化學(xué)刺激和溫度刺激均敏感,尤其在致敏作用之后,這些神經(jīng)分布在漿膜層、肌層、尿路上皮層,多種介質(zhì)包括物質(zhì)P(SP)、神經(jīng)激肽A、降鈣素基因相關(guān)蛋白(CGRP)、血管活性腸肽、腦啡肽等均可調(diào)節(jié)傳入神經(jīng)通路。盡管如此,膀胱局部神經(jīng)末梢病理性疼痛目前研究并不十分清楚,參與膀胱疼痛的化學(xué)介質(zhì)亟待進(jìn)一步探究。H2S現(xiàn)在被認(rèn)為是-NO和CO之后-的第三種氣體小分子,其在生理和病理?xiàng)l件下均發(fā)揮重要作用。在哺乳動(dòng)物組織中,H2S以L-半胱氨酸為底物,在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的催化下內(nèi)源性生成。H2S生成酶在人和哺乳動(dòng)物膀胱中均廣泛表達(dá),并且具有保守性。H2S具有多種生理作用,例如保護(hù)細(xì)胞、抑制腫瘤發(fā)展、調(diào)節(jié)炎性過(guò)程、參與內(nèi)臟疼痛調(diào)節(jié)、改變平滑肌運(yùn)動(dòng)功能等。H2S可促進(jìn)膀胱逼尿肌的舒張,改善人及動(dòng)物模型下尿路癥狀;H2S在炎癥過(guò)程中的作用是雙向的;H2S可增強(qiáng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱疼痛行為,盡管已經(jīng)證明H2S能夠介導(dǎo)膀胱疼痛,但是H2S通過(guò)何種機(jī)制影響膀胱疼痛以及間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征沒(méi)有系統(tǒng)的研究。目前有多種小鼠模型模擬IC/BPS的一種或多種癥狀,我們采用膀胱灌注蛋白酶激活受體4激活肽(PAR4-AP)構(gòu)建小鼠疼痛模型,因?yàn)榈鞍酌讣せ钍荏w4有明顯的誘發(fā)疼痛效應(yīng),而且IC/BPS患者尿液中蛋白酶水平明顯增高。本課題欲通過(guò)以下兩部分內(nèi)容探討硫化氫通路在蛋白酶激活受體4相關(guān)膀胱疼痛中的作用及可能機(jī)制:(1)探究硫化氫信號(hào)通路通過(guò)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)介導(dǎo)蛋白酶激活受體4(PAR4)誘發(fā)的小鼠膀胱疼痛模型;(2)探究H2S信號(hào)通路對(duì)蛋白激活受體4誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型膀胱炎癥以及排尿行為的影響。第一部分硫化氫信號(hào)通路介導(dǎo)蛋白酶激活受體4(PAR4)誘導(dǎo)的膀胱痛閾改變目的膀胱灌注PAR4-AP誘導(dǎo)膀胱疼痛模型,給予H2S相關(guān)藥物進(jìn)行處理,檢測(cè)小鼠膀胱疼痛行為的改變,以及小鼠膀胱中H2S及相關(guān)酶的改變,從而探究硫化氫信號(hào)通路在蛋白酶激活受體4(PAR4)中誘導(dǎo)膀胱痛閾改變的作用。方法1.實(shí)驗(yàn)分組10-13周齡健康雌性C57BL/6J小鼠分為12組,前10組每組隨機(jī)分配24只小鼠,最后2組每組隨機(jī)分配6只小鼠,小鼠用戊巴比妥鈉麻醉,插入尿管(PE10,長(zhǎng)11mm),按壓腹部排出尿液。其中,前10組小鼠每組18只小鼠處理之前手術(shù)切除雙側(cè)輸尿管,以防止腎臟來(lái)源的尿液影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,膀胱灌注1小時(shí)后收集尿液并處死,尿液至于-80℃冰箱儲(chǔ)存;前10組其余6只小鼠以及后2組小鼠不施行手術(shù),僅給予膀胱灌注,24小時(shí)后檢測(cè)小鼠疼痛行為以及排尿行為。SV-HUC-1細(xì)胞置于24孔板、在含有10%胎牛血清的F12K 培養(yǎng)基中孵育,實(shí)驗(yàn)前1小時(shí),用新鮮的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,分為16組,每組重復(fù)3次。2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程由弱到強(qiáng)使用四種不同力度的Von Frey纖維絲0.008g、0.020g、0.040g、0.070g分別刺激小鼠下腹部,記錄給予小鼠藥物24小時(shí)前后不同力度下的膀胱疼痛反應(yīng);利用蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測(cè)膀胱組織中H2S生成酶CBS和CSE的表達(dá)情況;利用免疫組織化學(xué)染色(IHC)檢測(cè)膀胱組織中CBS和CSE表達(dá)的部位;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)檢測(cè)cbs和cse的表達(dá)情況;利用H2S釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人、小鼠模型、細(xì)胞模型中H2S生成酶活性;利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞及膀胱組織、膀胱灌注液中MIF表達(dá)情況。3.數(shù)據(jù)處理所有的數(shù)據(jù)利用SPSS進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用t檢驗(yàn)或者one-way ANOVA,每組至少六只小鼠,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,以P0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.硫化氫信號(hào)系統(tǒng)存在于小鼠膀胱粘膜和人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠膀胱和人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞中有CBS和CSE表達(dá);免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)證明CBS和CSE廣泛表達(dá)于小鼠膀胱粘膜層細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。為了檢測(cè)小鼠膀胱組織和人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞中是否能夠產(chǎn)生H2S,我們留取模型小鼠膀胱灌注1小時(shí)后的膀胱灌注液以及人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞勻漿物行硫化氫釋放實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示小鼠膀胱灌注液可檢測(cè)到H2S,并且CBS抑制劑AOAA和CSE抑制劑PAG處理組小鼠膀胱灌注液H2S水平減少,NaHS處理組小鼠膀胱灌注液H2S水平增高;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與之相對(duì)應(yīng)。2.蛋白酶激活受體4(PAR4)激活后硫化氫信號(hào)系統(tǒng)上調(diào)熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PAR4-AP或者對(duì)照肽處理后人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞和模型小鼠膀胱CBS和CSE的表達(dá)量,然而,CBS和CSE蛋白表達(dá)量并沒(méi)有明顯差異;H2S釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示PAR4-AP處理后的人膀胱SV-HUC-1細(xì)胞、模型小鼠膀胱以及人正常膀胱組織H2S生成量均明顯增加。3.硫化氫介導(dǎo)蛋白酶激活受體4誘導(dǎo)的膀胱疼痛超敏感對(duì)不同組別小鼠處理之后,利用VonFrey纖維絲刺激小鼠腹部和盆部區(qū)域并且記錄陽(yáng)性反應(yīng)的次數(shù)。使用AOAA預(yù)處理之后能夠完全抑制PAR4誘導(dǎo)的痛覺(jué)超敏感;使用NaHS預(yù)處理之后能夠明顯增強(qiáng)PAR4誘導(dǎo)的痛覺(jué)超敏感;使用SAM或者PAG預(yù)處理之后僅僅部分改變PAR4誘導(dǎo)的小鼠痛覺(jué)超敏感。并且,PAG、AOAA、SAM、NaHS在PAR4未激活的情況下不會(huì)明顯地改變疼痛閾值。我們進(jìn)一步檢測(cè)上述處理之后H2S生成量,我們發(fā)現(xiàn)PAG或者AOAA預(yù)處理之后能夠明顯減少H2S生成量,并且AOAA的抑制效應(yīng)明顯強(qiáng)于PAG,表明PAG只能部分緩解疼痛。細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PAG、AOAA、PAG+AOAA均能明顯降低H2S生成量。2017年文獻(xiàn)報(bào)道新型的CBS抑制劑Benserazide,我們對(duì)其在此模型中的作用進(jìn)行了小鼠行為學(xué)檢測(cè),Benserazide在PAR4未激活的情況下不會(huì)明顯地改變疼痛閾值,而在PAR4激活的情況下,只能部分抑制小鼠痛覺(jué)超敏感。4.硫化氫可能通過(guò)MIF介導(dǎo)蛋白酶激活受體4誘導(dǎo)的膀胱疼痛CSE抑制劑PAG(10mM)和CBS激動(dòng)劑SAM(1mM)預(yù)處理的細(xì)胞勻漿物處理組和對(duì)照組相比MIF蛋白水平?jīng)]有明顯改變,然而,CBS抑制劑AOAA(1mM或者5mM)預(yù)處理的細(xì)胞勻漿物MIF蛋白水平升高,H2S供體NaHS(1mM或者5mM)或者CBS激動(dòng)劑SAM(5mM)預(yù)處理的細(xì)胞勻漿物MIF蛋白水平明顯降低;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上,CBS抑制劑AOAA(50mg/kg)預(yù)處理的膀胱組織勻漿物MIF蛋白水平明顯升高,但是CSE抑制劑PAG(100mg/kg)預(yù)處理的膀胱組織勻漿物實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MIF蛋白水平?jīng)]有明顯變化;H2S供體NaHS(50nM)預(yù)處理的膀胱組織勻漿物MIF蛋白水平明顯降低,但是CBS激動(dòng)劑SAM(100mg/kg)預(yù)處理的膀胱組織勻漿物實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MIF蛋白水平?jīng)]有明顯變化;膀胱灌注液的結(jié)果與之相對(duì)應(yīng)。結(jié)論1.CBS和CSE在SV-HUC-1細(xì)胞以及小鼠膀胱組織中表達(dá)并能發(fā)揮作用,內(nèi)源性產(chǎn)生H2S;我們首次證明CBS存在于小鼠膀胱。2.蛋白酶激活受體4激活后能夠增強(qiáng)SV-HUC-1細(xì)胞以及小鼠膀胱組織中硫化氫合成酶活性,從而促進(jìn)SV-HUC-1細(xì)胞以及小鼠膀胱組織中H2S生成,系我們首次發(fā)現(xiàn)。3.膀胱內(nèi)灌注PAR4-AP能夠引起膀胱痛覺(jué)超敏感,而且這種疼痛能夠被H2S增強(qiáng)。4.H2S可能通過(guò)MIF介導(dǎo)PAR4小鼠膀胱疼痛模型。第二部分硫化氫信號(hào)通路對(duì)蛋白酶激活受體4(PAR4)誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型炎癥以及排尿功能的影響目的構(gòu)建PAR4-AP誘導(dǎo)膀胱疼痛模型,給予H2S相關(guān)藥物進(jìn)行處理,檢測(cè)小鼠膀胱炎癥指標(biāo)改變情況,以及小鼠排尿行為,從而探討硫化氫信號(hào)通路對(duì)蛋白酶激活受體4(PAR4)誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型炎癥以及排尿功能的影響。方法1.實(shí)驗(yàn)分組構(gòu)建蛋白酶激活受體4誘導(dǎo)的小鼠間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征模型同第一部分構(gòu)建環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征模型,10-13周齡健康雌性C57BL/6J小鼠分為4組,每組隨機(jī)分配4只小鼠。(1)環(huán)磷酰胺(i.p.200mg/kg)4小時(shí)后處死;(2)生理鹽水(i.p.)4小時(shí)后處死;(3)環(huán)磷酰胺(i.p.75mg/kg)分別于第1天、第4天、第7天注射,第8天處死;(4)生理鹽水(i.p.)分別于第1天、第4天、第7天注射,第8天處死。2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程稱重小鼠膀胱以及小鼠體重,根據(jù)比值判斷膀胱水腫程度;利用HE染色方法從組織學(xué)角度檢測(cè)小鼠膀胱水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥程度;利用無(wú)創(chuàng)小鼠排尿行為檢測(cè)尿斑實(shí)驗(yàn)法(VSA)檢測(cè)小鼠排尿量及排尿頻率的情況;利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)TNFα、IL4表達(dá)量改變。3.數(shù)據(jù)處理所有的數(shù)據(jù)利用SPSS進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用t檢驗(yàn)或者one-way ANOVA,每組至少六只小鼠,以P0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.硫化氫介導(dǎo)蛋白酶激活受體4膀胱疼痛模型不引起膀胱水腫我們稱重小鼠膀胱以及小鼠體重,取其比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比,比值沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征模型能引起明顯的膀胱水腫,小鼠膀胱與體重比值,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;H2S本身不會(huì)引起膀胱水腫,并且也不會(huì)引起PAR4誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型膀胱水腫。2.硫化氫介導(dǎo)蛋白酶激活受體4膀胱疼痛模型不引起膀胱組織學(xué)炎性改變PAR4誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型不引起明顯的膀胱炎性改變,而環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠間質(zhì)性膀胱炎模型能引起明顯的膀胱炎癥,表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),粘膜水腫;H2S本身不會(huì)引起膀胱水腫,并且也不會(huì)引起PAR4誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型膀胱炎癥。3.硫化氫介導(dǎo)蛋白酶激活受體4膀胱疼痛模型不引起排尿行為學(xué)改變PAR4激活,經(jīng)過(guò)H2S相關(guān)藥物的處理,小鼠尿斑數(shù)目、尿斑總面積、主尿斑數(shù)目、主尿斑總面積以及主尿斑總面積/尿斑總面積均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.硫化氫在蛋白酶激活受體4相關(guān)炎性因子中的作用熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)蛋白酶激活受體4激活后Th1型轉(zhuǎn)錄因子T-bet沒(méi)有變化,但是Th2型轉(zhuǎn)錄因子GATA-3明顯增高;ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TNFα沒(méi)有明顯改變,而IL4表達(dá)明顯增加;但是H2S處理之后IL4表達(dá)均降低。結(jié)論1.蛋白酶激活受體4引起的膀胱疼痛不伴有明顯膀胱炎性改變,H2S在其中亦不發(fā)揮抗炎或者促炎效應(yīng)。2.蛋白酶激活受體4引起的膀胱疼痛不伴有排尿行為改變,H2S在其中亦不影響排尿行為。3.蛋白酶激活受體4引起的膀胱疼痛影響Th2型細(xì)胞以及IL4的表達(dá)。4.縱觀全局,蛋白酶激活受體4誘導(dǎo)的膀胱疼痛模型是一種新型的間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征小鼠模型,能夠引起膀胱痛覺(jué)超敏感,但是不伴有明顯的膀胱炎性改變以及排尿行為變化。H2S合成酶活性異常以及H2S含量的異�？赡芘c蛋白酶激活受體4激活后膀胱疼痛行為改變密切相關(guān)。H2S/CBS/CSE信號(hào)通路在間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征中可能發(fā)揮重要作用,我們的研究為診斷和治療間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R694
【圖文】：

逑附錄圖表逡逑圖１逡逑Ａ邐ｑＰＣＲ邐Ｂ逡逑１邋５－１邐Ｅ２３邋ＣＢＳ逡逑？ｉ邐丁邋Ｅ３ＣＳＥ逡逑８１逡逑Ｍｏｕｓｅ邋Ｂｌａｄｄｅｒ邐Ｍｏｕｓｅ邋Ｂｌａｄｄｅｒ逡逑Ｃ~杘ぃ櫻殄澹義希悖猓簀灞╁危徨義希卞澹殄濉鰣義蠌Γ峰�？．辶x希澹危粒希粒鈴危義希�，邋？＇邋＾＃？ｙｓＭｖ埼ＰＡＧ邋－逦＋逦－逦－辶x希ュ澹礤澹睿浚簀澹危危危義賢跡斃∈蟀螂漬襯け澩錚茫攏雍停茫櫻�，并且产生｝x玻印＃ǎ粒┦凳庇舛垮義希校茫壹觳廡∈蟀螂字校茫攏雍停茫櫻畔嘍員澩锪�；（n┑鞍子〖Ｊ笛榧觳廡″義鮮蟀螂字校茫攏雍停茫櫻瘧澩锪浚唬ǎ茫┟庖咦櫓舊觳猓茫攏雍停茫櫻佩義顯諦∈蟀螂字械畝ㄎ�；（Ｄ）ＡＯＡｂ忓（Ｃn右種萍粒擔(dān)埃恚紓耄紓鼓で蛔⑸洌╁義匣蛘擼校粒清澹ǎ茫櫻乓種萍�，１００ｍ＜偗ｋ＜偓腹膜腔注射）预处理馈时，或者辶x希危幔齲渝澹ǎ齲玻庸┨�，�(dān)板澹睿恚錚歟螂墜嘧ⅲ┰ご恚保搗種櫻酉呂窗螂墜噱義獻(xiàn)㈠澹校粒遙矗粒繡澹ǎ保埃板澹穡停保擔(dān)埃酰歟┗蛘叨哉針模ǎ保埃板澹穡�，１�(dān)埃酰歟┏中澹卞逍∈�，辶x霞觳餑蛞褐校齲玻雍�。数据以乞滪�

本文編號(hào)：2724477