【摘要】：背景:腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是常見的泌尿系中高發(fā)病率惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的2%-3%,其中腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常見的,也是最具侵略性的腎細(xì)胞癌,除手術(shù)治療并沒有其他有效的治療方案,但術(shù)后患者的復(fù)發(fā)率高,約占20%-40%,因此研究ccRCC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。CRK是一類接頭蛋白,最初作為一種癌基因產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)于禽類肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域組成。CRKL是CRK家族中的一員,在各個組織中廣泛表達(dá)。最近研究表明:CRKL的異常表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。然而對于CRKL與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制及可能參與的信號通路的研究較少,值得進(jìn)一步深入研究。MicroRNA(miRNAs)是一類包含21-25個堿基的單鏈非編碼RNA。miRNAs通過與AGO2蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體,進(jìn)而結(jié)合靶向基因的3’-UTR區(qū)引發(fā)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯過程。miR-200家族包括miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-429,miR-141。研究發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中作為腫瘤抑制因子參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移。而miR-200家族在腎癌中報道較少,值得深入研究。在TargetScan生物信息學(xué)軟件上發(fā)現(xiàn)miR-200家族與CRKL存在潛在靶向關(guān)系,因此miR-200家族與CRKL的在腎透明細(xì)胞癌中的調(diào)控關(guān)系值得深入探究。ETV6,又稱TEL,是轉(zhuǎn)錄因子ETS家族中的一員,在疾病的發(fā)展進(jìn)程中有重要的作用。通過生物信息學(xué)軟件分析,我們發(fā)現(xiàn)其能與miR-200家族的啟動子區(qū)結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。目的:1.CRKL表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌,786-O,ACHN細(xì)胞的關(guān)系探究;2.miR-200家族與腎透明細(xì)胞癌關(guān)系探究;3.腎透明細(xì)胞癌中miR-200家族如何調(diào)控CRKL;4.腎透明細(xì)胞癌中ETV6如何調(diào)控miR-200家族和CRKL。方法:1.利用Lipofectamine~(TM)2000介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染miR-200家族mimic,以及陰性對照組NC-mimic,并用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率;2.Transwell小室檢測miR-200家族表達(dá)變化對786-O和ACHN細(xì)胞遷移侵襲能力的影響,WB檢測EMT相關(guān)分子的表達(dá)變化;3.構(gòu)建雙熒光素酶載體psiCHECK-mut CRKL-site1,psiCHECK-mutCRKL-site2,psiCHECK-wtCRKL-site1,psiCHECK-wtCRKL-site2及psiCHECK-wtCRKL-site1+site2,檢測miR-200家族對CRKL的靶向作用;4轉(zhuǎn)染ETV6的小干擾序列si-ETV6,qRT-PCR檢測miR-200家族的表達(dá);5.轉(zhuǎn)染si-ETV6后,Transwell檢測786-O和ACHN細(xì)胞的遷移侵襲能力;6.轉(zhuǎn)染si-ETV6后,WB檢測CRKL和EMT相關(guān)分子的表達(dá);7.CoIP,WB實(shí)驗(yàn)檢測CRKL和ETV6是否能直接作用,探究三者之間的調(diào)控關(guān)系;8.qRT-PCR檢測腎透明細(xì)胞癌臨床樣本中mi R-200家族,CRKL,ETV6的相對表達(dá)量,WB檢測CRKL,ETV6,EMT相關(guān)分子的相對表達(dá)量。結(jié)果:1.786-O和ACHN細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi R-200 mimic后能抑制其遷移侵襲能力,其中miR-429和miR-200c的作用抑制效果最明顯;2.WB證明,786-O和ACHN細(xì)胞過表達(dá)miR-200分子后,能抑制CRKL的表達(dá),并抑制CRKL/SOS1/Ras/Raf/MMP9信號通路,其中miR-429和miR-200c的抑制作用最明顯;3.成功構(gòu)建psiCHECK-mutCRKL-site1,psiCHECK-mut CRKL-site2,psiCHECK-wtCRKL-site1及psiCHECK-wtCRKL-site2雙熒光素酶載體;4.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-429和miR-200c可以靶向調(diào)控CRKL3’-UTR區(qū);5.ETV6下調(diào)后能促進(jìn)miR-200家族的表達(dá),抑制786-O和ACHN細(xì)胞的遷移侵襲能力;6.CoIP實(shí)驗(yàn)證明CRKL可以和ETV6直接作用,并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-CRKL后,能降低細(xì)胞核中CRKL-ETV6復(fù)合物的表達(dá),調(diào)控miR-200家族的表達(dá);7.WB實(shí)驗(yàn)證明在40例腎透明細(xì)胞癌臨床樣本中,CRKL和ETV6的蛋白水平高表達(dá),qRT-PCR檢測在26例腎透明細(xì)胞癌臨床樣本,miR-429和miR-200c低表達(dá),與CRKL和ETV6的mRNA水平?jīng)]有相關(guān)性,與CRKL和ETV6的蛋白水平負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1.miR-200家族表達(dá)水平和786-O和ACHN細(xì)胞的遷移侵襲能力負(fù)相關(guān);2.miR-200家族抑制CRKL的表達(dá),抑制CRKL/SOS1/MMP9信號通路;3.miR-429和miR-200c能靶向調(diào)控CRKL3’-UTR區(qū),并且兩個靶向位點(diǎn)中CRKL3’-UTR 3728-3735區(qū)是主要靶向位點(diǎn);4.ETV6下調(diào)促進(jìn)miR-200家族表達(dá)水平,抑制786-O和ACHN細(xì)胞的遷移侵襲能力;5.CRKL可以和ETV6直接結(jié)合,調(diào)控mi R-200家族的表達(dá);6.腎透明細(xì)胞癌臨床樣本中,ETV6和CRKL的蛋白水平高表達(dá)和miR-200c/429低表達(dá)負(fù)相關(guān),ETV6和CRKL的蛋白水平和miR-200c/429家族水平負(fù)相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11
【圖文】：

圖 1-1：miR-200 家族與 CRKL3’UTR 區(qū)潛在的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測iR-200 家族過表達(dá)抑制 786-O 和 ACHN 體外遷移侵襲能力1）腎癌細(xì)胞 786-O 和 ACHN 中轉(zhuǎn)染 miR-200 家族 mimic 24h 后檢測其，如圖 1-2-1 所示，在 786-O 細(xì)胞中，miR-200 家族 5 個成員表達(dá)水平000 倍以上（p＜0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在 ACHN 細(xì)胞中，miR-2 個成員表達(dá)水平都上升了 500 倍以上（p＜0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明，轉(zhuǎn)染 miR-200 家族 mimic 24h 后，miR-200 家族在 786-O 和 ACH上調(diào)，且 786-O 的轉(zhuǎn)染效果更顯著。轉(zhuǎn)染成功，保障進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖 1-1：miR-200 家族與 CRKL3’UTR 區(qū)潛在的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測2. miR-200 家族過表達(dá)抑制 786-O 和 ACHN 體外遷移侵襲能力（1）腎癌細(xì)胞 786-O 和 ACHN 中轉(zhuǎn)染 miR-200 家族 mimic 24h 后檢測其轉(zhuǎn)染效率，如圖 1-2-1 所示，在 786-O 細(xì)胞中，miR-200 家族 5 個成員表達(dá)水平上升了 1000 倍以上（p＜0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在 ACHN 細(xì)胞中，miR-200 家族 5 個成員表達(dá)水平都上升了 500 倍以上（p＜0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 miR-200 家族 mimic 24h 后，miR-200 家族在 786-O 和 ACHN 中顯著上調(diào)，且 786-O 的轉(zhuǎn)染效果更顯著。轉(zhuǎn)染成功，保障進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

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本文編號：2724330