發(fā)布時間：2020-06-21 15:49

【摘要】：研究背景和目的膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿外科臨床上常見的惡性腫瘤之一,也是一個在全球范圍內危害人類健康的棘手問題。雖然隨著醫(yī)療水平及腫瘤診治能力的提升,膀胱癌的治療也出現(xiàn)新思路,但是目前膀胱癌的治療仍是以外科手術切除為主,同時輔以放療、化療、免疫治療、靶向治療及介入治療等的綜合治療。在我國,膀胱癌的發(fā)病率雖遠不及西方發(fā)達國家,但其發(fā)病率及死亡率在近幾十年來同樣呈上升趨勢。因此,對膀胱癌發(fā)生、進展、侵襲轉移、復發(fā)及耐藥等相關機制的研究已經(jīng)成為當前的熱點和重點,以期探尋新靶點為其診治提供理論依據(jù)。泛素相關結構域樣蛋白2(ubiquitin-associated domain-containing protein 2,UBAC2)是一種存在于多物種的高度保守的蛋白質,其表達水平在不同類型及病理級別的膀胱癌中存在差異,但UBAC2在膀胱癌中的作用及機制仍有待明確。因此,本研究旨在探究UBAC2在人膀胱癌組織中的表達情況并分析其與臨床病理相關指標的關系,最后初步探索其在膀胱癌中作用及機制。研究對象和方法1.收集我院46例因膀胱癌而行根治性膀胱切除術后的新鮮手術標本及患者相應臨床病理資料,取手術切除下來的膀胱癌組織及其對應正常膀胱黏膜組織,采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測并分析組織標本中UBAC2基因mRNA的表達水平,同時分析UBAC2表達水平和膀胱癌患者臨床病理特征間的關系。2.同時采用免疫組織化學染色法(immunohistochemistry,IHC)檢測UBAC2蛋白在膀胱癌組織及其對應癌旁正常膀胱組織中的表達水平,并分析其差異。3.采用qRT-PCR和western blot法分別檢測并分析人永生化膀胱尿路上皮細胞系SV-HUC-1和膀胱癌細胞系EJ及UMUC3中UBAC2基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平。4.根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站The Human Protein Atlas利用癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中膀胱癌患者相關臨床隨訪數(shù)據(jù)及UBAC2表達水平制作Kaplan-Meier生存曲線,分析膀胱癌患者腫瘤組織中UBAC2表達水平和患者預后之間的關系。5.構建短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)介導UBAC2沉默的質粒載體,并轉染入EJ和UMUC3細胞,轉染48h后,更換新鮮完全培養(yǎng)基,加入嘌呤霉素,逐漸加量進行細胞篩選。6.結合熒光倒置顯微鏡觀察篩選細胞熒光情況,分別提取沉默對照組(shNC)和UBAC2沉默組(shUBAC2)穩(wěn)轉細胞總RNA和蛋白,利用qRTPCR及western blot法檢測UBAC2 mRNA及蛋白沉默效率。7.利用穩(wěn)轉細胞,應用CCK-8試劑盒及平板克隆形成實驗檢測UBAC2沉默組及對照組細胞增殖能力的變化。8.采用qRT-PCR及western blot檢測UBAC2沉默組(shUBAC2)及對照組(shNC)細胞中與增殖相關蛋白表達水平的變化,明確UBAC2與p27間的可能調控關系。結果1.與正常膀胱組織(1.220±0.797)相比,UBAC2基因mRNA在膀胱癌組織(3.802±2.931)中表達明顯上調(P0.001)。免疫組織化學染色法檢測結果發(fā)現(xiàn),相對于其對應癌旁正常膀胱組織,UBAC2蛋白在大部分(31/46)膀胱癌組織中表達升高。對于膀胱癌細胞系,qRT-PCR結果顯示:與SV-HUC-1(1.000±0.029)細胞相比,膀胱癌細胞系EJ(2.273±0.040)和UMUC3(3.037±0.115)中UBAC2 mRNA水平均明顯上調(P0.001)。Western blot結果也顯示:EJ細胞和UMUC3細胞中UBAC2蛋白相對于SV-HUC-1細胞表達升高(P0.001)。2.臨床病理特征分析表明,UBAC2表達水平與膀胱癌病理分級明顯相關(P=0.023),而與年齡、性別、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤大小等均無明顯相關(P0.05)。3.生存分析發(fā)現(xiàn),膀胱癌組織中UBAC2表達的高低與膀胱癌患者的生存時間顯著相關(P=0.035)。膀胱癌中UBAC2表達水平越高,膀胱癌患者的生存時間越短;相反,UBAC2表達水平越低,患者的生存時間越長。4.轉染shRNAs并經(jīng)篩選后,qRT-PCR及western blot檢測顯示shUBAC2組細胞UBAC2 mRNA及蛋白的表達水平較shNC組明顯降低(P0.05),其中以shUBAC2-1及shUBAC2-3沉默效率較高,用于后續(xù)實驗。5.CCK-8實驗顯示:EJ和UMUC3細胞中,shUBAC2組較shNC組在相對應時間點450nm波長下的吸光度明顯降低(P0.05);平板克隆形成實驗顯示EJ和UMUC3細胞中,shUBAC2組克隆形成數(shù)明顯少于shNC組(P0.001)。6.western blot結果顯示:EJ和UMUC3細胞中,shUBAC2組細胞p27蛋白表達水平較shNC組都明顯升高(P0.05),而其他與增殖相關蛋白:p21,CyclinD1,CyclinE,CDK2,CDK4,CDK6無明顯差異(P0.05)。qRT-PCR發(fā)現(xiàn),EJ和UMUC3細胞中,shUBAC2組細胞p27 mRNA表達水平均較shNC組明顯升高(P0.05)。結論1.UBAC2在膀胱癌組織及細胞系中的表達水平明顯上調,并且可以作為一個預測膀胱癌患者的預后指標。2.沉默UBAC2能夠抑制膀胱癌細胞的增殖。3.UBAC2可能在轉錄水平上調控p27。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14
【圖文】：

C2 在膀胱癌組織和細胞系中的表達明顯上調 UBAC2 基因在膀胱癌組織中表達水平，我們同時采用了方法分別在 mRNA 和蛋白水平檢測 46 對膀胱癌及其對應的 UBAC2 基因的表達。qRT-PCR 結果顯示：與正常膀胱組相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌組織（3.802±2.93.05）（圖 3.1.1）。免疫組織化學染色法檢測結果發(fā)現(xiàn)，相對于AC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌組織中表達升高（以圖

±0.797）相比，UBAC2 基因 mRNA 水平在膀胱癌組織（3.802±2.931）中明顯上調（P<0.05）（圖 3.1.1）。免疫組織化學染色法檢測結果發(fā)現(xiàn)，相對于正常膀胱組織，UBAC2 蛋白在大部分（31/46）膀胱癌組織中表達升高（以圖 3.1.2 為典型）。圖 3.1.1 qRT-PCR 檢測 UBAC2 基因 mRNA 在 46 對膀胱癌及其對應正常癌旁組織中癌組織表達水平上調

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本文編號：2724282