【摘要】：研究背景據(jù)調(diào)查全世界大約8%的育齡男性存在生育障礙,男性不育患者至少達(dá)到2000萬(wàn)。男性不育的病因是多方面的,已知的原因包括:先天性或獲得性泌尿生殖系統(tǒng)異常,惡性腫瘤,泌尿生殖道感染,陰囊溫度升高,內(nèi)分泌紊亂,免疫因素和一些特征性的遺傳異常。但仍有大約40%的男性不育患者的病因尚不明確。盡管輔助生殖技術(shù)為不孕不育患者帶來(lái)了福音,但大約有一半的夫婦即使經(jīng)過(guò)多次治療仍未能成功懷孕。因此研究不育癥的分子機(jī)制將有助于將來(lái)不育癥的精確診斷和精準(zhǔn)治療。第一部分畸形精子的細(xì)胞力學(xué)研究目的:以特發(fā)性不育癥家系患者的精子作為研究對(duì)象,用原子力顯微鏡研究精子頭部的力學(xué)特征以及力學(xué)特征和染色質(zhì)凝集的關(guān)系。方法:收集不育癥家系病患的精液標(biāo)本和正常生育能力的志愿者的精液標(biāo)本。采用上游法分離精子。使用原子力顯微鏡觀察單個(gè)無(wú)定型頭畸形精子和單個(gè)正常精子的活體形貌,精子表面粗糙度,并表征單個(gè)精子的物理學(xué)特性。對(duì)比分析正常形態(tài)精子和頭部畸形精子之間的形貌差異以及物理學(xué)特性的差異。分析精子物理學(xué)特性和染色質(zhì)凝集之間的關(guān)系。采用苯胺藍(lán)染色、精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)試驗(yàn)(sperm chromatin structure assay,SCSA)、免疫印跡法以及透射電鏡來(lái)檢測(cè)精子染色質(zhì)凝集狀態(tài)。結(jié)果:發(fā)現(xiàn)頭部畸形精子的表面形貌,物理學(xué)特性,染色質(zhì)凝集狀態(tài)與正常形態(tài)精子顯著不同。頭部畸形精子的長(zhǎng)、寬、高均大于正常精子。頂體后區(qū)長(zhǎng)度也大于正常精子。頭部畸形精子的表面粗糙度大于正常精子(343.21±94.71 nm vs.232.10±49.65 nm(P0.0001),剛度小于正常精子(3.54±0.52 vs.4.25±1.39;P0.001)。苯胺藍(lán)染色和免疫印跡法結(jié)果均提示畸形精子的組蛋白沒(méi)有完全被魚(yú)精蛋白替換。SCSA結(jié)果顯示與正常精子相比畸形精子呈現(xiàn)高DNA可染率(high DNA stainability,HDS)(26.95±2.75%vs.9.40±2.87%;P0.001),和高精子DNA碎片率(DNA fragmentation index,DFI)(45.69±2.15%vs.8.02±2.57%;P0.001)。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散。Pearson檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精子核區(qū)剛度和染色質(zhì)凝集程度呈正相關(guān)。結(jié)論:精子的物理學(xué)特征可以作為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的新指標(biāo)。本研究首次采用物理學(xué)方法來(lái)研究精子,為進(jìn)一步了解畸形精子癥做出了貢獻(xiàn)。第二部分特發(fā)性男性不育癥家系的蛋白組學(xué)研究目的:以不育癥家系病患的精子和正常精子為研究對(duì)象,通過(guò)雙向電泳和MALDI-TOF-MS技術(shù)研究病患精子和正常精子的差異蛋白圖譜,探討畸精不育的分子機(jī)制。方法:收集不育癥家系病患的精液標(biāo)本和40例生育力正常的志愿者的精液標(biāo)本。采用密度梯度離心分離精子,尿素/硫脲法提取精子蛋白。2-DE分離差異蛋白,銀染后用PDQuest8.0軟件分析比較病患精子和正常精子的電泳圖譜,尋找差異蛋白點(diǎn)。對(duì)差異蛋白點(diǎn)行MALDI-TOF-MS分析,將獲得的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)分析。利用DAVID軟件對(duì)差異蛋白行功能聚類(lèi)分析,利用STRING軟件預(yù)測(cè)差異蛋白間相互作用。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)獲得清晰且重復(fù)性好的異常精子組和正常精子組的雙向凝膠電泳圖譜。兩組的2-DE圖譜中有26個(gè)點(diǎn)發(fā)生明顯變化,其中12個(gè)上調(diào),14個(gè)下調(diào)。將26個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定成功鑒定了26個(gè)蛋白。其中在特發(fā)性男性不育癥家系患者中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì):Semenogelin-1、Semenogelin-2、SEMG2 protein。其中表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì):ropporin-1A isoform a、clusterin preproprotein、ASRGL1protein、Glutathione S-transferase Mu 3、Tubulin alpha-3E chain、Tubulin beta-4B chain、Succinate--CoA ligase[ADP-forming]subunit beta,mitochondrial、Sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome C、SPANX-C。功能富集分析顯示,這些差異蛋白主要涉及結(jié)合、催化、分子結(jié)構(gòu)這三種分子功能。結(jié)論:差異表達(dá)蛋白Semenogelin-1 preproprotein,Semenogelin-2preproprotein,SEMG2;GSTMu3可能與家系患者精子的運(yùn)動(dòng)能力低下有關(guān)。差異表達(dá)蛋白TUBB4B,TUBA3E,Ropporin,SPANX-C可能與家系患者精子畸形有關(guān)。差異表達(dá)蛋白CLU,HYOU1,SUCLA2可能與家系患者精子數(shù)量減少有關(guān)。第三部分特發(fā)性男性不育家系的基因組學(xué)研究目的:以特發(fā)性男性不育家系患者為研究對(duì)象。篩選并鑒定導(dǎo)致不育的致病基因,為臨床上不育癥患者的基因診斷和遺傳咨詢提供理論依據(jù)。方法:研究對(duì)象是兩個(gè)不育癥兄弟。首先,以其父母是近親婚配為切入點(diǎn),采用全外顯子組重測(cè)序方法,對(duì)獲得的數(shù)據(jù)按單基因病模式進(jìn)行生物信息學(xué)分析,重點(diǎn)關(guān)注可能致病的純合突變。然后,對(duì)家系內(nèi)所有成員行Sanger測(cè)序驗(yàn)證全外顯子組測(cè)序的結(jié)果,并在家系內(nèi)進(jìn)行表型與基因型共分離分析。再用計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)建模來(lái)預(yù)測(cè)突變導(dǎo)致的功能后果。最后,用Fasttarget二代測(cè)序驗(yàn)證候選致病突變?cè)?24例散發(fā)病患和200例具有生育力的健康人群中的突變情況。結(jié)果:在近親婚配家系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的純合錯(cuò)義突變FBXO43(c.1991CT/p.Gly664Asp)。在該家系基因突變與表型共分離,并且該基因突變被SIFT,PolyPhen-2和Mutation Taster預(yù)測(cè)為突變蛋白具有致病性。計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)建模預(yù)測(cè)突變p.Gly664Asp導(dǎo)致FBXO43蛋白增加了一個(gè)α-螺旋并縮短兩個(gè)β-折疊,這可能是導(dǎo)致功能異常的原因。在124例散發(fā)不育癥患者中對(duì)FBXO43進(jìn)行突變篩查,鑒定出另外4個(gè)具有雜合FBXO43突變的病例。并且在200例正常對(duì)照中,未發(fā)現(xiàn)FBXO43突變。結(jié)論:FBXO43突變可能是導(dǎo)致不育癥家系患病的原因。FBXO43突變可能與男性不育癥和畸形精子癥有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R698.2
【圖文】：

1 精子鞭毛超微結(jié)構(gòu)模式圖（引自 Csilla Krausz）。精子由兩部分組成：頭部和其中鞭毛分為４個(gè)節(jié)段，分別是頸段、中段、主段和末端；a.正常精子鞭毛。失動(dòng)力蛋白臂。c. 鞭毛缺失放射幅鞭毛。d. 鞭毛缺失中央微管（9+0 結(jié)構(gòu)）。1 The axoneme ultrastructure and its defects found in patients with multiple morphrmalities of the sperm flagella and primary ciliary dyskinesia. (a) Normal sperm axxoneme lacking dynein arms. (c) Axoneme without radial spokes. (d) Absence of thpair of microtubules of the axoneme (structure 9 + 0).弱精子癥的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示鞭毛不同組分的表達(dá)減少。有六項(xiàng)關(guān)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中[20-25]，其中有三個(gè) ODF2 表達(dá)下降[23-25]。O除小鼠表現(xiàn)為精子尾部缺陷，包括缺少 個(gè)或多個(gè)微管，尾部彎曲，子活力下降[26]。TEKTs（TEKT1，TEKT4 和 TEKT5）也在弱精子癥下調(diào)[20,23,24]。 TEKTs 蛋白定位于鞭毛中的微管、基體和中心粒。目人類(lèi)的五種 TEKTs（TEKT1，TEKT2，TEKT3,TEKT4 和 TEKT5）和精子中表達(dá)。他們定位于鞭毛，并且?guī)缀醵级ㄎ挥诰�粒體鞘、外周纖維鞘[27]。TEKT3 和 TEKT1 定位于精子的頂體區(qū)[28,29]。TUBB2B 是

圖 1-2 巨頭精子癥相關(guān)基因示意圖（引自 An Bracke）Fig1-2 Representation of the genes linked to Macrozoospermia圓頭精子癥也是 種非常罕見(jiàn)的疾病，不育男性的發(fā)病率不到 0.1%。它點(diǎn)是精子頭部呈圓形，缺乏頂體，核膜異常和中段缺陷[49]。頂體缺乏是精生后期的生物學(xué)事件，精子頭部呈圓形是其主要形態(tài)學(xué)特征[50]。無(wú)頂體精能通過(guò)透明帶與卵母細(xì)胞融合，精子不能激活卵母細(xì)胞導(dǎo)致受精失敗，即使

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本文編號(hào)：2723814