【摘要】：目的:睪丸扭轉(zhuǎn)作為泌尿外科急癥之一,扭轉(zhuǎn)后的復位引發(fā)的相關(guān)損傷是典型睪丸缺血再灌注損傷,對睪丸的生理結(jié)構(gòu)和生精功能損害甚大,甚者可能導致不育。本研究探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)來源的外泌體對睪丸缺血再灌注損傷保護作用,為探討睪丸扭轉(zhuǎn)治療提供新方向。方法:從3-4周齡大鼠的骨髓中采用原代培養(yǎng)方法分離出骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),培養(yǎng)并鑒定大鼠BMSCs。通過觀察原代培養(yǎng)出來細胞貼壁的不同時間段的細胞生長形態(tài),用流式細胞儀器檢測原代培養(yǎng)細胞的表面特有蛋白標記物,并對其進行向成骨細胞和成脂肪細胞分化的誘導來證實我們已成功地分離和培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。以去外泌體血清大量培養(yǎng)并收集細胞上清,對收集細胞上清采用超速離心的方法提取BMSCs來源的外泌體,并對所提物質(zhì)采用納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)分析其大小,透射電子顯微鏡觀察(TEM)其形態(tài)以及蛋白免疫印跡法檢測其典型標志蛋白質(zhì)來鑒定提取確為外泌體。構(gòu)建雄性SD大鼠睪丸缺血再灌注損傷(IRI)模型,24只健康青春期雄性SD大鼠隨機分為三組;A:假手術(shù)組(Sham組),缺血再灌注組(I/R組)分為兩組:B組:生理鹽水處理組(I/R+NS),C 組:BMSCs 來源外泌體(100ug/ml)處理組(I/R+BMSCs-exo)。最后取各組大鼠扭轉(zhuǎn)側(cè)(左側(cè))睪丸,采用共聚焦觀察外泌體在睪丸內(nèi)的分布,光學顯微鏡檢測各組睪丸組織病理學結(jié)構(gòu)改變并對其進行HE組織結(jié)構(gòu)的評分以及精原細胞對外泌體的攝取情況,采用生物化學的方法檢測各組睪丸組織中Superoxide Dismutase(SOD,超氧化物歧化酶),Malondialdehyde(MDA,丙二醛),Nitric Oxide Synthesis(NOS 一氧化氮合成酶),Total antioxidant capacity(T-AOC,總抗氧化能力)和Catalase(CAT,過氧化氫酶)的含量。同時采用蛋白免疫印跡法檢測各組睪丸組織中高遷移率族蛋B1(HMGB1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白3(Caspases-3),Bax及B淋巴細胞瘤-2基因(BCL-2)蛋白表達水平。結(jié)果:成功地從大鼠骨髓中分離和培養(yǎng)BMSCs,并成功提取了 BMSCs分泌的外泌體。在缺血再灌注損傷動物模型中,A組(Sham)睪丸形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)層次分明,生殖細胞排列整齊有序,有正常的生精小管和生精細胞。與假手術(shù)組對比,B組(I/R+NS)睪丸組織損傷最顯著,表現(xiàn)為管腔內(nèi)可見大量滲出,空泡形成。生精細胞排列紊亂,細胞層次不清,生精上皮或一定程度缺失或脫落。而在C組(I/R+BMSCs-exo)治療組中,睪丸結(jié)構(gòu)雖紊亂但有一定層次,生殖細胞排列緊密,生精細胞空泡形成和雜亂無章的上皮細胞有一定程度的減少且在HE組織結(jié)構(gòu)評分上有明顯的統(tǒng)計學意義(p0.05)。鏡下觀察到精原細胞能攝取外泌體,且外泌體能透過血睪屏障達到睪丸里面。睪丸組織生化指標檢測中,B 組(I/R+NS)組織中的 MDA 和 NOS(tNOS and iNOS)的含量較 A 組(Sham)升高且具有統(tǒng)計學意義(p0.01),而SOD,T-AOC和CAT的含量與A組(Sham)相比則有統(tǒng)計學上降低(p0.01)。而在經(jīng)外泌體處理之后的C組(I/R+BMSCs-exo)中,與生理鹽水處理組B組(I/R+NS)相比較,組織中MDA和NOS(tNOS and iNOS)的含量有一定意義的降低(p0.05),且SOD,T-AOC和CAT的水平有統(tǒng)計學意義升高(p0.5)。蛋白免疫印跡檢測睪丸組織相關(guān)蛋白表達中,與 A 組(Sham)相比,Caspases-3,Bax,HMGB1 在 B 組(I/R+NS)的表達水平顯著升高(***p0.001),BCL-2的表達水平則下降(p0.05),C組(I/R+BMSCs-exo)中,Caspases-3,Bax,HMGB1 表達水平有一定程度的降低(p0.01)以及BCL-2一定程度表達水平的升高(p0.05)。結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)來源的外泌體對睪丸缺血再灌注損傷有抗氧化,減少炎癥與凋亡的保護作用。為后續(xù)臨床上對睪丸扭轉(zhuǎn)復位后及其相關(guān)并發(fā)癥治療提供新的方向和研究基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R697.22
【圖文】：

逑求其平均值，連續(xù)計數(shù)一周（７天）。以時間為縱坐標，細胞個數(shù)為橫坐標繪制逡逑生長曲線圖（如圖２所示）。逡逑２．３骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定逡逑⑴處理細胞：取Ｐ３邋ＢＭＳＣｓ進行消化及細胞計數(shù)板計數(shù)，每管１００＾１分別入７逡逑個ＥＰ管，約２ｘｌ0６個細胞；設(shè)ＣＤ３４及其同型對照管、ＣＤ４４及其同型對照管、逡逑ＣＤ４５和ＣＤ９０及其同型對照管；逡逑（２）

邐第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（ＢＭＳＣｓ）原代、傳代培養(yǎng)及鑒定邐逡逑２．骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導分化逡逑（１）成脂肪細胞的誘導：ＭＳＣｓ經(jīng)成脂肪誘導液培養(yǎng)２１ｄ后，經(jīng)Ｏｉｌ邋Ｒｅｄ邋０（油逡逑紅０）染色，在漩渦狀緊密排列的細胞集落中央可觀察到散在的充滿脂滴的脂防逡逑細胞形成。陽性顯示脂滴為紅色（圖３Ｃ），對照組染色為陰性（圖３Ａ）逡逑（２）成骨細胞的誘導：ＭＳＣｓ經(jīng)成骨誘導液培養(yǎng)２１ｄ后，細胞形態(tài)由梭形變?yōu)殄义隙嘟切�，細胞呈多層性重疊性排列，間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)。茜素逡逑紅染色陽性呈棕色，對照組染色為陰性（圖３Ｂ）。（如下圖所示）逡逑

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：2722206