發(fā)布時間：2020-06-17 00:46

【摘要】：研究背景和目的： 自1982年,Moorhead等首次提出“脂質(zhì)腎毒性”學(xué)說以來,大量的研究結(jié)果表明,高脂血癥和脂質(zhì)在腎臟沉積是發(fā)生腎小球硬化的重要危險因素,而腎小球硬化的病理生理和組織學(xué)變化,如血脂異常、病變早期表現(xiàn)內(nèi)皮損害、后期出現(xiàn)系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)積聚,這些機制與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制相似,因此提出了“腎小球動脈硬化”這一概念。近年來,氧化低密度脂蛋白(oxLDL)在腎小球硬化及間質(zhì)纖維化中的作用越來越受到關(guān)注,成為研究熱點。臨床和實驗研究表明,高脂血癥可以使oxLDL在腎臟沉積、炎癥細胞浸潤、腎臟固有細胞增生和損傷、細胞外基質(zhì)積聚及泡沫細胞形成,直接或間接地導(dǎo)致腎小球硬化。既往對脂質(zhì)在腎臟沉積導(dǎo)致腎損害的研究,多集中在腎臟系膜細胞及內(nèi)皮細胞,而Joles的實驗證明oxLDL可以同時對腎臟系膜細胞、內(nèi)皮細胞和足細胞造成損傷,在諸多損傷中足細胞可能是最主要的受害者。 足細胞是一種高度分化的腎臟固有細胞,在體內(nèi)足細胞伸出足突包繞在腎小球基底膜(GBM)上,形成裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)復(fù)合體,這一結(jié)構(gòu)在維持腎小球濾過屏障中起重要作用。足細胞損傷是腎病蛋白尿形成的重要原因之一,在腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Bussolati等研究發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠介導(dǎo)足細胞SD蛋白nephrin表達缺失而致細胞損傷,但有關(guān)oxLDL介導(dǎo)足細胞損傷的具體調(diào)控機制,尚未得到深入的研究,因此建立可靠的oxLDL誘導(dǎo)腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積模型,探索影響足細胞攝取oxLDL的機制,對于減輕足細胞損傷以及延緩腎小球硬化而言,可能是一種極具前景的治療策略。 Gutwein等的體內(nèi)和體外實驗證明在人腎組織足細胞上存在CXC趨化因子配體16(CXC chemokine ligand16,CXCL16)的表達。CXCL16在體內(nèi)有兩種存在形式：膜結(jié)合型CXCL16和可溶型CXCL16�？缒XCL16的一個重要作用是oxLDL的清道夫受體。oxLDL通過細胞膜上的清道夫受體介導(dǎo)進入細胞,造成細胞內(nèi)脂質(zhì)大量積聚,導(dǎo)致泡沫細胞形成。金屬蛋白水解酶10(a disintegrin and metalloprotease10, ADAM-10)是兩種形式轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素,參與誘導(dǎo)CXCL16從細胞膜的脫落。新近的研究認為,炎性細胞因子如干擾素-γ (INF-γ)和腫瘤壞死因子-a (TNF-a)可以增加CXCL16在人足細胞內(nèi)以及可溶形式的表達。有關(guān)跨模型CXCL16是否參與體外培養(yǎng)鼠源性腎小球足細胞oxLDL攝取,以及干擾素-γ和ADAM10抑制劑可能的調(diào)控作用,國內(nèi)外研究甚少。 他汀類藥物是近年來發(fā)現(xiàn)的有效的調(diào)脂藥。大量實驗和臨床研究資料顯示,該類藥具有顯著的降脂作用。他汀類藥物在體內(nèi)主要的作用是通過選擇性阻斷膽固醇合成的限速酶結(jié)合位點,影響膽固醇生物合成,同時代償性促進低密度脂蛋白(LDL)受體合成,加速LDL降解,從而降低血脂。目前研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物不僅有依賴降血脂的腎臟保護作用,而且還有抗細胞增殖、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)及抑制清道夫受體表達等非依賴降血脂的腎臟保護作用,但確切機制尚不明確。辛伐他汀是最有效、應(yīng)用最為廣泛的一種他汀類藥物,目前關(guān)于辛伐他汀對清道夫受體介導(dǎo)的鼠源腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積的影響尚未見報道。 本研究首次采用油紅染色觀察小鼠腎小球條件性永生足細胞對oxLDL攝取情況,探討足細胞攝取oxLDL與CXCL16蛋白表達的關(guān)系,旨在建立oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積模型,為研究足細胞攝取oxLDL的機制及其可能存在的調(diào)控因素提供可靠的實驗基礎(chǔ)。通過體外觀察INF-γ、CXCL16特異性抗體和ADAM10抑制劑對足細胞攝取oxLDL的影響以及CXCL16蛋白表達的變化,初步探討可能調(diào)控足細胞脂質(zhì)氧化損傷的因素。此外,通過觀察辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積及CXCL16、nephrin蛋白表達的影響,探討辛伐他汀對足細胞的保護作用機制。 第一部分oxLDL誘導(dǎo)小鼠足細胞脂質(zhì)蓄積模型的建立 目的：觀察oxLDL誘導(dǎo)小鼠腎小球條件永生性足細胞脂質(zhì)蓄積情況,旨在建立oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積模型,為研究足細胞攝取oxLDL的機制及其可能存在的調(diào)控因素提供可靠的實驗基礎(chǔ)。 方法：采用體外培養(yǎng)的小鼠腎小球條件永生性足細胞株(MPC5)作為研究對象,在37℃無干擾素-γ的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10-14d至其分化成熟后,分別加入梯度濃度為20,40,80,160μg/ml的oxLDL,孵育24h及48h后,油紅0染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況；比色法檢測細胞內(nèi)總膽固醇濃度。結(jié)果：油紅0染色可見：與對照組相比,20、40μg/ml oxLDL組作用24h及48h,細胞中均未發(fā)現(xiàn)明顯脂滴；80、160μg/ml oxLDL組作用24h有少許脂滴出現(xiàn),作用48h均發(fā)現(xiàn)明顯脂滴。 細胞內(nèi)總膽固醇濃度定量分析結(jié)果顯示,不同濃度oxLDL孵育足細胞24h脂質(zhì)蓄積不明顯,細胞內(nèi)總膽固醇濃度分別為97.5±29.6μ g/ml、101.3±36.4μ g/ml、110.6±35.1μ g/m1、121.5±26.4u g/ml,與對照組組(90.3±30.1u g/m1)相比,各組細胞內(nèi)總膽固醇濃度均無顯著性差異(P均0.05)。不同濃度oxLDL孵育足細胞48h,與對照組(102.6±33.5μ g/m1)相比,低濃度oxLDL(20、40μ g/m1)組無明顯變化,細胞內(nèi)總膽固醇濃度分別為98.4±31.2μg/ml、103.6±31.9μg/m1(P0.05)；高濃度oxLDL(80及160μg/m1)組,細胞內(nèi)總膽固醇濃度顯著增高,分別為201.0±20.3u g/ml、278.0±35.1μg/m1(P0.05,P0.01)；且高濃度oxLDL組孵育48h與24h比較,隨著孵育時間延長,細胞內(nèi)總膽固醇濃度顯著增高(P0.05,P0.01)。 結(jié)論：首次用油紅染色觀察足細胞脂質(zhì)蓄積,方法簡便實用。oxLDL誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性和時間依賴性。80μg/ml oxLDL誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠腎小球條件永生足細胞株48h,油紅染色可見顯著脂質(zhì)沉積,細胞內(nèi)膽固醇含量顯著增高,成功構(gòu)建脂質(zhì)蓄積模型。 第二部分不同刺激因素對oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積和CXCL16表達的影響 目的：觀察重組小鼠細胞因子IFN-γ、 CXCL16單克隆抗體和ADAM10抑制劑對體外培養(yǎng)的小鼠腎小球足細胞攝取oxLDL以及足細胞CXCL16蛋白表達的影響,初步探討足細胞脂質(zhì)蓄積的影響因素和調(diào)控機制。 方法：體外培養(yǎng)小鼠腎小球條件永生性足細胞(MPC5),在37℃無干擾素-γ的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14d至其分化成熟后,分別加不同處理因素：1.oxLDL(80ug/ml)與不同濃度干擾素-γ(5.0,10.0,20.OU/ml)共同孵育細胞48h和oxLDL(80ug/ml)與干擾素-γ(20.0U/ml)共同孵育細胞24h及48h;2.oxLDL(80ug/ml)與梯度濃度CXCL16單克隆抗體(0.625,1.25,2.5,5.0,10.0ug/ml)共同孵育細胞48h和oxLDL(80ug/ml)與CXCL16抗體(5.0ug/ml)共同孵育細胞24h及48h；3.oxLDL(80ug/ml)與梯度濃度ADMA10抑制劑(0.125,0.25,0.5,1.0,2.0ug/ml)共同孵育細胞48h。另設(shè)Ctrl組(不給藥),oxLDL組(只加80ug/ml oxLDL)。油紅染色觀察足細胞脂質(zhì)蓄積情況,比色法檢測足細胞內(nèi)總膽固醇濃度,Western blot檢測足細胞CXCL16的蛋白表達。 結(jié)果：1.干擾素-γ對oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積及CXCL16蛋白表達的影響1.1干擾素-γ對oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積的影響：油紅染色結(jié)果顯示,oxLDL組及oxLDL與各濃度IFN-γ共同孵育組均出現(xiàn)大量脂滴。與Ctrl組相比,oxLDL+各濃度IFN-γ共同孵育組,細胞內(nèi)總膽固醇含量顯著增加,分別為209.2±44.7ug/ml、211.9±22.6ug/ml、273.8±27.1ug/ml(P0.05；P0.01)；與oxLDL組比較,oxLDL+IFN-γ(20U/ml)組細胞內(nèi)總膽固醇含量顯著增加(P0.05)。用oxLDL(80μg/ml)與IFN-γ(20U/ml)共同孵育足細胞24h及48h,細胞內(nèi)總膽固醇含量分別為174.9±22.1ug/ml及275.3±12.4ug/ml,結(jié)果顯示隨著作用時間延長,細胞內(nèi)總膽固醇含量顯著增加(P0.01)。此外,oxLDL與IFN-γ共同孵育組,細胞內(nèi)總膽固醇含量均高于同期oxLDL組(P0.05)。1.2干擾素-γ對足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達的影響：Western blot定量分析結(jié)果顯示,oxLDL組及oxLDL+各濃度IFN-γ孵育組足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達顯著高于Ctrl組(P0.05)；與oxLDL組比較,oxLDL+IFN-γ(20U/ml)組CXCL16蛋白表達顯著增加(P0.05)。時效性研究發(fā)現(xiàn),oxLDL組CXCL16的蛋白表達在孵育48h與24h比較無明顯變化,不隨時間延長而增加；而oxLDL與IFN-γ(20U/ml)共同孵育組,細胞內(nèi)CXCL16的蛋白水平在48h與24h比較,隨作用時間延長而顯著增加(P0.05)。 2.CXCL16單克隆抗體對oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積及CXCL16蛋白表達的影響 2.1CXCL16抗體對足細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響：油紅染色結(jié)果顯示,與oxLDL組相比,oxLDL與低濃度(0.625μg/ml、1.25μg/ml) CXCL16抗體共同孵育48h油紅染色無明顯變化；而oxLDL與高濃度(2.5、5.0和10.0μg/ml) CXCL16抗體共同孵育48h,細胞內(nèi)脂滴均明顯減少。細胞內(nèi)膽固醇檢測結(jié)果顯示,與oxLDL組比較,oxLDL與低濃度(0.625μ g/m1、1.25μ g/m1)CXCL16抗體共同孵育48h,細胞內(nèi)總膽固醇含量分別為203.8±24.8u g/ml及174.1±15.1μ g/ml,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；oxLDL與高濃度(2.5、5.0和10.0μ g/m1)CXCL16抗體共同孵育48h組,細胞內(nèi)總膽固醇含量呈劑量依賴性降低,分別為147.2±15.1ug/ml、100.7±11.4ug/ml及84.1±9.1ug/ml(P0.05；P0.01)。 2.2CXCL16抗體對足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達的影響：Western blot定量檢測結(jié)果顯示,足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達水平隨CXCL16抗體濃度增加呈劑量依賴性降低。與oxLDL組比較,oxLDL與低濃度(0.625μg/ml、1.25μg/ml) CXCL16抗體共同孵育48h組,CXCL16蛋白的表達無顯著變化；而oxLDL與高濃度(2.5、5.0和10.0μg/ml) CXCL16抗體共同孵育48h組,細胞內(nèi)CXCL16蛋白的表達顯著降低(P0.05；P0.01)。以oxLDL(80μg/ml)與同一濃度(5.0μ g/m1)CXCL16抗體共同孵育足細胞24h及48h后,與oxLDL組相比,oxLDL與CXCL16抗體共同孵育組足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達均顯著降低(P0.05)。 3. ADAM10抑制劑對oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積和CXCL16表達的影響 3.1ADAM10抑制劑對細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響：油紅染色結(jié)果顯示,與oxLDL組相比,oxLDL分別與0.125μg/m1及0.25μg/mlADAM10抑制劑共同孵育48h,細胞內(nèi)脂滴無顯著變化；oxLDL分別與0.5μ g/ml,1.0μ g/m1和2.0ug/mlADAM10抑制劑共同孵育48h,細胞內(nèi)脂滴顯著增加。比色法結(jié)果顯示,與oxLDL組比較,oxLDL與0.125μ g/ml及0.25μg/mlADAM10抑制劑共同孵育48h組,細胞內(nèi)總膽固醇的含量略增高,分別為211.6±12.6μ g/m1及227.8±18.3μ g/ml,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；oxLDL與0.5μ g/ml,1.0μ g/ml和2.0u g/mlADAM10抑制劑共同孵育48h組,細胞內(nèi)總膽固醇的含量顯著增加(P0.05；P0.01),分別為258.5±26.8u g/ml、284.0±23.2μg/ml、338.3±26.6μ g/ml。 3.2ADAM10抑制劑對細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達的影響：Western blot定量分析結(jié)果顯示,與oxLDL組比較,oxLDL與0.125μg/ml及0.25μg/mlADAM10抑制劑共同孵育組,足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達略增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；oxLDL與0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/mlADAM10抑制劑共同孵育組,足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達顯著增加(P0.05；P0.01)。結(jié)論：1oxLDL誘導(dǎo)體外培養(yǎng)鼠源腎小球足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達顯著增加,提示oxLDL可能上調(diào)足細胞內(nèi)清道夫受體CXCL16的數(shù)量并被過度攝取,導(dǎo)致細胞內(nèi)膽固醇聚集。 2在體外培養(yǎng)條件下,oxLDL與一定濃度的IFN-γ共同孵育足細胞,可使細胞內(nèi)脂滴增多,總膽固醇含量增高,同時發(fā)現(xiàn)足細胞內(nèi)CXCL16蛋白表達顯著增加。提示干擾素-Y通過誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞CXCL16表達上調(diào),促進足細胞對oxLDL的攝取。 3在體外培養(yǎng)條件下,oxLDL與一定濃度的CXCL16抗體共同孵育足細胞,可見細胞內(nèi)脂滴明顯減少,總膽固醇含量顯著降低,同時發(fā)現(xiàn)足細胞內(nèi)CXCL16蛋白水平顯著降低。提示應(yīng)用CXCL16抗體阻斷足細胞CXCL16蛋白表達,可顯著降低足細胞對oxLDL的攝取及脂質(zhì)蓄積。 4在體外培養(yǎng)條件下,oxLDL與一定濃度的ADAM10抑制劑共同孵育足細胞,可見細胞內(nèi)脂滴顯著增多,總膽固醇含量顯著增加,同時發(fā)現(xiàn)足細胞內(nèi)CXCL16蛋白水平顯著增加。提示ADAM10抑制劑可顯著增加足細胞CXCL16表達,從而促進足細胞對oxLDL的攝取。 第三部分辛伐他汀對oxLDL誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積干預(yù)機制的探討 目的：觀察辛伐他汀干預(yù)前后oxLDL誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞脂質(zhì)蓄積及CXCL16、 nephrin蛋白表達的變化,探討其對小鼠腎小球足細胞的保護機制。 方法：用80μg/ml oxLDL與不同濃度的辛伐他汀(1.0μg/ml、2.0μg/ml)共同孵育小鼠腎小球條件永生性足細胞48h,另設(shè)空白對照組(不給藥),oxLDL組(只加80μg/ml oxLDL),辛伐他汀組(只加1.0μg/ml辛伐他汀)。油紅0染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況,比色法檢測細胞總膽固醇濃度,Western blot檢測足細胞CXCL16/nephrin蛋白的表達。 結(jié)果：油紅0染色可見,與oxLDL組比較,oxLDL+辛伐他汀各組細胞內(nèi)脂滴明顯減少。比色法檢測發(fā)現(xiàn),對照組細胞內(nèi)總膽固醇含量為90.3±30.1μ g/ml,辛伐他汀組為93.3±28.6μg/ml,oxLDL組為226.5±21.6u g/ml,oxLDL+辛伐他汀組分別為151.8±6.8μ g/ml和135.5±26.9μ g/ml。與對照組比較,辛伐他汀組細胞總膽固醇含量無顯著變化(P0.05)；與oxLDL組比較,oxLDL+辛伐他汀各組細胞總膽固醇含量顯著降低(P0.05)。Western blot檢測足細胞CXCL16蛋白的表達水平,與對照組比較,辛伐他汀組CXCL16蛋白表達無改變(P0.05)；與oxLDL組比較,oxLDL+辛伐他汀各組CXCL16表達顯著降低(P0.05)。nephrin蛋白的表達檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,辛伐他汀組nephrin蛋白表達無改變(P0.05),oxLD組nephrin表達顯著降低(P0.01)；與oxLDL組比較,oxLDL+辛伐他汀各組nephrin表達水平顯著增加(P0.05)。結(jié)論：1.經(jīng)辛伐他汀和oxLDL共同孵育的鼠源足細胞內(nèi)脂滴明顯減少,總膽固醇濃度顯著降低,足細胞CXCL16蛋白表達水平亦顯著降低。提示辛伐他汀下調(diào)oxLDL誘導(dǎo)的鼠源腎小球足細胞CXCL16蛋白表達,減少足細胞吞噬脂質(zhì),從而減輕足細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。 2.oxLDL誘導(dǎo)鼠源足細胞nephrin蛋白表達顯著下降,經(jīng)辛伐他汀和oxLDL共同孵育的足細胞內(nèi)nephrin蛋白表達顯著增加,提示oxLDL誘導(dǎo)鼠源足細胞nephrin蛋白表達缺失而致足細胞損傷,辛伐他汀能夠上調(diào)oxLDL誘導(dǎo)的鼠源腎小球足細胞nephrin蛋白表達,對于穩(wěn)定足細胞功能意義重大。 創(chuàng)新和意義： 1.首次用油紅0染色直觀地觀察oxLDL誘導(dǎo)鼠源腎小球足細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況,方法簡便實用、經(jīng)濟,可重復(fù)性強。oxLDL誘導(dǎo)足細胞脂質(zhì)蓄積模型的建立,為研究足細胞攝取oxLDL的機制及其調(diào)控因素提供可靠的實驗基礎(chǔ)。 2.通過體外細胞培養(yǎng),證實CXCL16是介導(dǎo)足細胞脂質(zhì)損傷的關(guān)鍵分子,其表達可被IFN-γ、ADAM10抑制劑等調(diào)控,從而影響足細胞攝取脂質(zhì),為臨床早期防治足細胞脂質(zhì)氧化損傷提供重要線索。 3.首次通過體外實驗證實,辛伐他汀干預(yù)能夠下調(diào)oxLDL誘導(dǎo)的鼠源腎小球足細胞CXCL16蛋白表達,減輕足細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；同時上調(diào)足細胞nephrin蛋白表達,從而減輕足細胞損傷,初步探討辛伐他汀對足細胞的保護作用,為臨床應(yīng)用他汀類藥物保護腎臟提供參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻】

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本文編號：2716831