【摘要】：目的探討沉默GNAI2(G protein alpha inhibiting activity polypeptide 2,GNAI2)基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3增殖、遷移、細(xì)胞周期和線粒體膜電位的影響。方法構(gòu)建能沉默GNAI2基因的重組質(zhì)粒載體及隨機(jī)序列對(duì)照載體;聯(lián)合兩個(gè)包裝質(zhì)粒ps PAX2和p MD2.G,用PEI介導(dǎo)三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝能夠沉默表達(dá)GNAI2的慢病毒及隨機(jī)序列對(duì)照的慢病毒;用兩組病毒分別轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞,構(gòu)建沉默表達(dá)GNAI2和表達(dá)隨機(jī)序列的細(xì)胞模型。分組:PC-3細(xì)胞組(NC組),隨機(jī)序列對(duì)照組(LV-SHCON),沉默GNAI2基因組(LV-SHGNAI2);用MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力;用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力;用PI(Propidium Iodide,PI)染色各組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化;用TMRE(Tetramethylrhodamine ethyl ester,TMRE)染色各組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化。結(jié)果1成功構(gòu)建攜帶GNAI2特異siRNA的重組質(zhì)粒和攜帶隨機(jī)序列的重組質(zhì)粒。2成功包裝攜帶GNAI2特異的si RNA的慢病毒和攜帶隨機(jī)序列的慢病毒。3成功構(gòu)建沉默GNAI2的前列腺癌細(xì)胞PC-3模型和攜帶隨機(jī)序列的對(duì)照細(xì)胞模型。4沉默表達(dá)GNAI2促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖:24h時(shí)各組細(xì)胞無明顯增殖,差異不顯著。48h時(shí)各組細(xì)胞增殖均有所升高,LV-SHGNAI2組分別與兩對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖差異明顯(P0.001),NC組和LV-SHCON組之間差異不顯著(P=0.214)。72小時(shí)時(shí)三組細(xì)胞增殖較多,LV-SHCON組分別與兩對(duì)照組相比,差異明顯(P0.001),NC組和LV-SHCON組之間差異不顯著(P=0.193)。5沉默GNAI2基因抑制了PC-3細(xì)胞的遷移能力:在劃痕24h后觀測(cè)并計(jì)算發(fā)現(xiàn),LV-SHGNAI2組細(xì)胞修復(fù)比例為(16.99±1.65),LV-SHCON組修復(fù)比例為(57.67±3.17),NC組修復(fù)比例為(53.43±2.12),LV-SHGNAI2組的修復(fù)比例明顯小于兩個(gè)對(duì)照組(P0.001),細(xì)胞的遷移能力明顯低于兩個(gè)對(duì)照組,NC組和LV-SNCON組細(xì)胞修復(fù)比例和遷移能力沒有明顯差異(P=0.074)。6沉默GNAI2基因使處于S期的PC-3細(xì)胞比例增加:LV-SHCON組G0/G1期的細(xì)胞比例為(55.9±1.72),S期為(32.48±3.66),G2/M期為(8±0.2);LV-SHGNAI2組G0/G1期的細(xì)胞比例為(57.62±0.67),S期為(41.27±1.73),G2/M期為(1.8±1.68),與LV-SHCON組相比,LV-SHGNAI2組S期細(xì)胞占比增加(P0.05),G2/M期細(xì)胞占比減少(P0.05),G0/G1期細(xì)胞占比并無變化(P=0.224)。7沉默GNAI2基因使PC-3細(xì)胞線粒體膜電位增加:LV-SHCON組細(xì)胞線粒體膜電位為(71.39±1.23),LV-SHGNAI2組為(91.08±2.8),差異顯著(P0.001)。結(jié)論沉默GNAI2基因的表達(dá)可以促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖,抑制PC-3細(xì)胞遷移,使其S期細(xì)胞增多,提高PC-3細(xì)胞線粒體膜電位水平,提示GNAI2對(duì)PC-3細(xì)胞生物學(xué)功能有重要影響,在前列腺癌的發(fā)生和演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

- 10 -圖 1 pLL3.7 質(zhì)粒圖譜Fig.2 pLL3.7 plasmid map2）設(shè)計(jì)可沉默 GNAI2 的序列及對(duì)照的隨機(jī)序列NCBI 中查詢 GNAI2 的基因序列，找到其 mRNA，登錄 sidirect（http://sidirect2.rnai.jp）查詢其特異性引物，同時(shí)登錄 sirna（http//sirna.wi.mit.edu）查詢引物，將從兩個(gè)網(wǎng)站查詢的引物進(jìn)行對(duì)比，并參照 siRNA 的設(shè)計(jì)原則（最好為 GN18，其中 GC 含量為 40%-60%，不能出現(xiàn)連續(xù)的 AAAA 或者 TTTT）選擇最佳引物。最后經(jīng)過比對(duì)以及對(duì) pLL3.7-EGFP 質(zhì)粒載體的酶切位點(diǎn)分析，再在兩側(cè)分別設(shè)計(jì)

- 21 -圖 2 a：DNAsis 軟件比對(duì)顯示敲低序列與官方序列完全吻合。b：Chromas 顯示隨機(jī)序列DNA 峰形規(guī)則。c：DNAsis 軟件比對(duì)顯示隨機(jī)序列與官方序列完全吻合。d：Chromas 顯示隨機(jī)序列 DNA 峰形規(guī)則Fig.2 a: Result compared by DNAsis shows that the knockdown sequence is fully consistent. b:Chromas shows the DNA peak of knockdown sequence is regular.c: Result compared by DNAsisshows that the random sequence is fully consistent.d: Chromas shows the DNA peak of knockdownsequence is regular.1.2.2 沉默組（LV-SHGNAI2）和隨機(jī)序列對(duì)照組（LV-SHCON）慢病毒包裝成功

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2716401