【摘要】：背景足細胞又稱為腎小球臟層上皮細胞,覆蓋在腎小球基底膜外側,其相鄰足突彼此交錯,構成腎小球濾過膜屏障的關鍵組成部分。足細胞還具有合成基底膜成分,維持腎小球形態(tài),調節(jié)腎小球血流等多種功能。很多腎小球疾病伴有足細胞損傷,導致細胞功能障礙或喪失,引起蛋白尿,嚴重的損傷導致足細胞數(shù)量減少,從而導致腎小球硬化和腎衰竭。足細胞是終末分化細胞,幾乎沒有增殖再生的能力,細胞周期抑制蛋白,包括p21,p27和p57的高表達是維持成熟足細胞低增殖能力的主要原因。目前有研究發(fā)現(xiàn),在某些腎小球疾病如細胞型局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎、塌陷性腎小球病以及人類免疫缺陷病毒(HIV)相關腎病,足細胞會重新進入細胞周期,重新進入細胞周期的足細胞對致病化合物的易感性增加。目前關于足細胞在病理狀態(tài)下重新進入細胞周期的具體分子生物學機制的研究甚少。Hippo通路是一條由一系列蛋白激酶和轉錄因子組成的激酶鏈,活化的Hippo信號通過使得其下游效應分子Yes相關蛋白(YAP)磷酸化增加,從而對其轉錄活性起到負性調控的作用,它的主要作用是限制組織的過度生長,并維持細胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)。目前有關研究發(fā)現(xiàn),YAP信號通路在足細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用,而其在足細胞細胞增殖及分化方面的作用尚無研究報道,本實驗擬通過體內外實驗探討YAP信號調節(jié)阿霉素誘導足細胞進入細胞周期及失分化中的作用。目的探討YAP信號在阿霉素腎病足細胞進入細胞周期及細胞失分化中的作用及其調節(jié)機制。方法體內實驗中,使用阿霉素腎病小鼠模型,考馬斯亮藍法檢測小鼠尿液白蛋白,肌氨酸氧化酶法檢測小鼠尿肌酐的水平。免疫組化染色檢測小鼠腎臟PCNA、CDK4、Cyclin D1、YAP及Desmin的表達。免疫熒光染色檢測小鼠腎臟足細胞標志蛋白Podocalyxin和Desmin、Snail2的共定位。本研究使用條件永恒的小鼠足細胞株5P12,15-25代分化的足細胞進行體外實驗研究。流式細胞儀檢測細胞周期,免疫熒光染色檢測PCNA、P-YAP、CDK4、Snail2及Desmin的表達。過表達質粒轉染上調足細胞YAP的表達。Real-time PCR檢測細胞周期相關基因及足細胞標志基因和失分化相關基因的表達。Western blot檢測蛋白質表達。結果阿霉素腎病小鼠在尾靜脈注射阿霉素(10mg/kg)8天后尿白蛋白肌酐比值開始上升,其中第16天的尿白蛋白肌酐比值明顯上升,為56.6±16.03(mg/mmol),與對照組4.05±0.44mg/mmol相比,p0.05。阿霉素腎病小鼠腎臟足細胞表達增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA),阿霉素刺激體外37°C培養(yǎng)的足細胞12h及24h之后,流式細胞儀檢測顯示足細胞進入細胞周期,其中進入S期的細胞比例分別為39.94±0.84%和41.18±1.46%,與對照組26.52±0.65%相比,p0.05。細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),阿霉素刺激4h、8h及12h之后,PCNA的表達上調。阿霉素腎病小鼠在給建模16天后腎小球足細胞開始表達細胞周期相關蛋白CDK4和CyclinD1。體外阿霉素孵育對足細胞細胞周期相關蛋白基因的表達水平無明顯影響。免疫印跡顯示阿霉素孵育足細胞4h及8h后,細胞周期相關蛋白CDK4和CyclinD1明顯上調,細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子P27和P21的表達無明顯改變。進一步實驗顯示YAP信號可能在調節(jié)足細胞重新進入細胞周期中發(fā)揮作用,體外實驗中予以阿霉素孵育足細胞4h和8h之后,磷酸化YAP的水平明顯降低,12h之后恢復基線值,細胞免疫熒光染色同樣證實這一結果。體內實驗免疫組化染色發(fā)現(xiàn),在阿霉素腎病小鼠腎臟中足細胞細胞核內YAP的表達明顯增加。體外過表達足細胞內YAP發(fā)現(xiàn)可促進足細胞進入細胞周期,同時上調細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達。予以YAP/TEAD結合抑制劑維替泊芬可以減弱阿霉素引起的細胞周期相關蛋白CyclinD1的表達上升,并同時減少進入S期細胞的比例。阿霉素孵育足細胞顯示間充質細胞相關基因α-SMA、PAX2、snail、desmin的表達上調,而足細胞標志蛋白WT1及ZO-1基因表達下調,而對Synaptopodin及Podocalyxin的表達無明顯影響。免疫印跡實驗顯示,阿霉素孵育后,足細胞內間充質細胞標記蛋白Snail2、Desmin的蛋白質表達上調,而緊密連接蛋白ZO-1的表達明顯下降。免疫熒光染色顯示,阿霉素小鼠腎臟組織Podocalyxin分別Desmin和Snail2存在共定位,免疫組化染色發(fā)現(xiàn)阿霉素小鼠腎臟足細胞存在CDK4和Desmin的共定位。體外使用成纖維細胞生長因子bFGF刺激分化成熟的足細胞,可使得足細胞重新進入細胞周期,并上調細胞周期相關蛋白CDK4和CyclinD1的表達。過表達足細胞內YAP可上調失分化相關蛋白Desmin和Snail2的表達。免疫熒光顯示,bFGF刺激分化成熟的足細胞可使CDK4分別和Snail2、Desmin共染的細胞比例增加,上調失分化相關基因的表達。免疫印跡結果顯示,bFGF刺激分化成熟的足細胞72h之后可明顯下調足細胞相關標志蛋白WT1、Podocalyxin、Nephrin的表達,并使得失分化相關蛋白Desmin和Snail2的表達增加,此外細胞上清液中可發(fā)現(xiàn)Nephrin蛋白。結論阿霉素可引起足細胞CDK4和Cyclin D1表達增高,從而重新進入細胞周期,該過程至少部分通過YAP信號介導。進入細胞周期的足細胞表面分化的標志脫落入培養(yǎng)液,同時高表達間充質細胞的標記Desmin和Snail2,引起細胞失分化。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692
【圖文】：

圖 1 阿霉素小鼠出現(xiàn)蛋白尿Figure 1：Adriamycin-induced proteinuria in mice注：*：與 control 組相比，P<0.051.3.2 部分受損傷的足細胞表達增殖核抗原PCNA 是增殖細胞核抗原，在 G0～G1 期細胞中無明顯表達，在 G1 晚期，它的表達大幅度增加，在 S 期達到高峰，而 G2～M 期則明顯下降，表達量的變化與 DNA 合成水平一致，因此，檢測其在細胞中的表達，可以作為評價細胞進入 G1 期的一個重要指標。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在阿霉素小鼠腎臟切片中可以看到足細胞中 PCNA 的表達，意味著在該動物模型中部分足細胞可能進入 G1 期，如圖 2 所示。

上海交通大學醫(yī)學院博士學位論文Figure 2：Partially damaged podocytes express cell proliferating nuclear antigen PCNA注：CON:control，箭頭所指為足細胞，放大倍數(shù)為 400 倍1.3.3 阿霉素刺激分化的足細胞表達增殖細胞核抗原 PCNA在體外實驗中，使用進行細胞免疫熒光，阿霉素 0.25ug/ml 刺激體外 37℃培養(yǎng)的足細胞發(fā)現(xiàn)，與 control 組相比，阿霉素刺激 4h、8h 及 12h 后，足細胞內增殖細胞核抗原 PCNA 的表達明顯增加，進一步驗證了動物實驗的結果。

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本文編號：2716165