【摘要】：背景足細(xì)胞又稱為腎小球臟層上皮細(xì)胞,覆蓋在腎小球基底膜外側(cè),其相鄰足突彼此交錯,構(gòu)成腎小球濾過膜屏障的關(guān)鍵組成部分。足細(xì)胞還具有合成基底膜成分,維持腎小球形態(tài),調(diào)節(jié)腎小球血流等多種功能。很多腎小球疾病伴有足細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或喪失,引起蛋白尿,嚴(yán)重的損傷導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少,從而導(dǎo)致腎小球硬化和腎衰竭。足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,幾乎沒有增殖再生的能力,細(xì)胞周期抑制蛋白,包括p21,p27和p57的高表達(dá)是維持成熟足細(xì)胞低增殖能力的主要原因。目前有研究發(fā)現(xiàn),在某些腎小球疾病如細(xì)胞型局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎、塌陷性腎小球病以及人類免疫缺陷病毒(HIV)相關(guān)腎病,足細(xì)胞會重新進(jìn)入細(xì)胞周期,重新進(jìn)入細(xì)胞周期的足細(xì)胞對致病化合物的易感性增加。目前關(guān)于足細(xì)胞在病理狀態(tài)下重新進(jìn)入細(xì)胞周期的具體分子生物學(xué)機制的研究甚少。Hippo通路是一條由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶鏈,活化的Hippo信號通過使得其下游效應(yīng)分子Yes相關(guān)蛋白(YAP)磷酸化增加,從而對其轉(zhuǎn)錄活性起到負(fù)性調(diào)控的作用,它的主要作用是限制組織的過度生長,并維持細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)。目前有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),YAP信號通路在足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用,而其在足細(xì)胞細(xì)胞增殖及分化方面的作用尚無研究報道,本實驗擬通過體內(nèi)外實驗探討YAP信號調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期及失分化中的作用。目的探討YAP信號在阿霉素腎病足細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期及細(xì)胞失分化中的作用及其調(diào)節(jié)機制。方法體內(nèi)實驗中,使用阿霉素腎病小鼠模型,考馬斯亮藍(lán)法檢測小鼠尿液白蛋白,肌氨酸氧化酶法檢測小鼠尿肌酐的水平。免疫組化染色檢測小鼠腎臟PCNA、CDK4、Cyclin D1、YAP及Desmin的表達(dá)。免疫熒光染色檢測小鼠腎臟足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Podocalyxin和Desmin、Snail2的共定位。本研究使用條件永恒的小鼠足細(xì)胞株5P12,15-25代分化的足細(xì)胞進(jìn)行體外實驗研究。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,免疫熒光染色檢測PCNA、P-YAP、CDK4、Snail2及Desmin的表達(dá)。過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)足細(xì)胞YAP的表達(dá)。Real-time PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因及足細(xì)胞標(biāo)志基因和失分化相關(guān)基因的表達(dá)。Western blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果阿霉素腎病小鼠在尾靜脈注射阿霉素(10mg/kg)8天后尿白蛋白肌酐比值開始上升,其中第16天的尿白蛋白肌酐比值明顯上升,為56.6±16.03(mg/mmol),與對照組4.05±0.44mg/mmol相比,p0.05。阿霉素腎病小鼠腎臟足細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA),阿霉素刺激體外37°C培養(yǎng)的足細(xì)胞12h及24h之后,流式細(xì)胞儀檢測顯示足細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期,其中進(jìn)入S期的細(xì)胞比例分別為39.94±0.84%和41.18±1.46%,與對照組26.52±0.65%相比,p0.05。細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),阿霉素刺激4h、8h及12h之后,PCNA的表達(dá)上調(diào)。阿霉素腎病小鼠在給建模16天后腎小球足細(xì)胞開始表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和CyclinD1。體外阿霉素孵育對足細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)蛋白基因的表達(dá)水平無明顯影響。免疫印跡顯示阿霉素孵育足細(xì)胞4h及8h后,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和CyclinD1明顯上調(diào),細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子P27和P21的表達(dá)無明顯改變。進(jìn)一步實驗顯示YAP信號可能在調(diào)節(jié)足細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期中發(fā)揮作用,體外實驗中予以阿霉素孵育足細(xì)胞4h和8h之后,磷酸化YAP的水平明顯降低,12h之后恢復(fù)基線值,細(xì)胞免疫熒光染色同樣證實這一結(jié)果。體內(nèi)實驗免疫組化染色發(fā)現(xiàn),在阿霉素腎病小鼠腎臟中足細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)YAP的表達(dá)明顯增加。體外過表達(dá)足細(xì)胞內(nèi)YAP發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)足細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期,同時上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)。予以YAP/TEAD結(jié)合抑制劑維替泊芬可以減弱阿霉素引起的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)上升,并同時減少進(jìn)入S期細(xì)胞的比例。阿霉素孵育足細(xì)胞顯示間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因α-SMA、PAX2、snail、desmin的表達(dá)上調(diào),而足細(xì)胞標(biāo)志蛋白WT1及ZO-1基因表達(dá)下調(diào),而對Synaptopodin及Podocalyxin的表達(dá)無明顯影響。免疫印跡實驗顯示,阿霉素孵育后,足細(xì)胞內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白Snail2、Desmin的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),而緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)明顯下降。免疫熒光染色顯示,阿霉素小鼠腎臟組織Podocalyxin分別Desmin和Snail2存在共定位,免疫組化染色發(fā)現(xiàn)阿霉素小鼠腎臟足細(xì)胞存在CDK4和Desmin的共定位。體外使用成纖維細(xì)胞生長因子bFGF刺激分化成熟的足細(xì)胞,可使得足細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期,并上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和CyclinD1的表達(dá)。過表達(dá)足細(xì)胞內(nèi)YAP可上調(diào)失分化相關(guān)蛋白Desmin和Snail2的表達(dá)。免疫熒光顯示,bFGF刺激分化成熟的足細(xì)胞可使CDK4分別和Snail2、Desmin共染的細(xì)胞比例增加,上調(diào)失分化相關(guān)基因的表達(dá)。免疫印跡結(jié)果顯示,bFGF刺激分化成熟的足細(xì)胞72h之后可明顯下調(diào)足細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白WT1、Podocalyxin、Nephrin的表達(dá),并使得失分化相關(guān)蛋白Desmin和Snail2的表達(dá)增加,此外細(xì)胞上清液中可發(fā)現(xiàn)Nephrin蛋白。結(jié)論阿霉素可引起足細(xì)胞CDK4和Cyclin D1表達(dá)增高,從而重新進(jìn)入細(xì)胞周期,該過程至少部分通過YAP信號介導(dǎo)。進(jìn)入細(xì)胞周期的足細(xì)胞表面分化的標(biāo)志脫落入培養(yǎng)液,同時高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記Desmin和Snail2,引起細(xì)胞失分化。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692
【圖文】：

圖 1 阿霉素小鼠出現(xiàn)蛋白尿Figure 1：Adriamycin-induced proteinuria in mice注：*：與 control 組相比，P<0.051.3.2 部分受損傷的足細(xì)胞表達(dá)增殖核抗原PCNA 是增殖細(xì)胞核抗原，在 G0～G1 期細(xì)胞中無明顯表達(dá)，在 G1 晚期，它的表達(dá)大幅度增加，在 S 期達(dá)到高峰，而 G2～M 期則明顯下降，表達(dá)量的變化與 DNA 合成水平一致，因此，檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)，可以作為評價細(xì)胞進(jìn)入 G1 期的一個重要指標(biāo)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在阿霉素小鼠腎臟切片中可以看到足細(xì)胞中 PCNA 的表達(dá)，意味著在該動物模型中部分足細(xì)胞可能進(jìn)入 G1 期，如圖 2 所示。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文Figure 2：Partially damaged podocytes express cell proliferating nuclear antigen PCNA注：CON:control，箭頭所指為足細(xì)胞，放大倍數(shù)為 400 倍1.3.3 阿霉素刺激分化的足細(xì)胞表達(dá)增殖細(xì)胞核抗原 PCNA在體外實驗中，使用進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光，阿霉素 0.25ug/ml 刺激體外 37℃培養(yǎng)的足細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與 control 組相比，阿霉素刺激 4h、8h 及 12h 后，足細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原 PCNA 的表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步驗證了動物實驗的結(jié)果。

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本文編號：2716165