【摘要】：研究背景糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)作為糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)的重要原因。越來(lái)越多的證據(jù)顯示腎小管間質(zhì)病變是DN發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此,研究糖尿病時(shí)腎小管、腎小管周毛細(xì)血管(Peritubular Capillary,PTC)及間質(zhì)微環(huán)境改變的機(jī)制和效應(yīng),有助于尋找治療DN新的干預(yù)位點(diǎn)。腺苷1型受體(A1 Adenosine Receptor,A1AR)在腎臟廣泛表達(dá),因其在腎臟管球反饋(Tubulo-glomerular Feedback,TGF)中的重要調(diào)控作用而受到廣泛關(guān)注,我們前期研究觀察到DN時(shí),A1AR基因敲除,加重DN但與TGF無(wú)關(guān)。而在造影劑腎病和缺血再灌注動(dòng)物模型中,觀察到A1AR存在不依賴(lài)于管球反饋的腎臟保護(hù)作用,DN時(shí)是否存在相似的情況,具體機(jī)制并不清楚。研究目的本研究將通過(guò)DN患者、A1AR基因敲除(A1AR-/-)DN小鼠動(dòng)物模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),從組織器官、細(xì)胞和分子水平觀察A1AR缺失對(duì)于DN腎小管周微環(huán)境(腎小管、間質(zhì)和腎小管周毛細(xì)血管)非依賴(lài)于管球反饋的損傷機(jī)制,了解激活A(yù)1AR對(duì)蛋白尿發(fā)生和腎臟纖維化機(jī)制的保護(hù)作用。1.建立A1AR缺失DN小鼠動(dòng)物模型,通過(guò)腎臟mRNA基因芯片譜檢測(cè)篩選差異表達(dá)基因,尋找A1AR參與DN發(fā)展的可能分子調(diào)節(jié)通路;2.在DN患者、小鼠模型中觀察A1AR缺失加重腎小管周微環(huán)境損傷,保護(hù)刷狀緣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Megalin破壞和小管間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制;3.體外細(xì)胞培養(yǎng)驗(yàn)證A1AR對(duì)高糖環(huán)境下近端小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;進(jìn)而為DN防治提供新的思路和潛在的干預(yù)位點(diǎn);4.觀察A1AR在DN水鹽代謝相關(guān)高血壓中的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。研究方法第一部分 DN模型的確立及A1AR參與DN的分子通路初篩1.納入腎活檢證實(shí)為糖尿病腎病患者,年齡性別匹配的腎小球輕微病變作為對(duì)照組,分析其臨床病理特點(diǎn),收集患者尿液提取外泌體進(jìn)行形態(tài)、粒徑及標(biāo)志物的鑒定,免疫印跡法檢測(cè)尿外泌體中A1AR及SGLT2蛋白;免疫熒光染色確定A1AR在DN患者腎臟的表達(dá)部位,免疫組化及半定量分析評(píng)估DN患者和動(dòng)物A1AR與對(duì)照組的表達(dá)差異。2.分別在C57/BL野生型及管球反饋缺失的A1AR-/-小鼠中,通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素120mg/kg建立1型DM動(dòng)物模型,選擇不同時(shí)間點(diǎn),血糖試紙檢測(cè)血糖、代謝籠留取24h尿標(biāo)本、尾夾法監(jiān)測(cè)血壓;觀察體重、血糖及尿量的變化,檢測(cè)尿白蛋白水平;常規(guī)病理染色及透射電鏡觀察野生型及A1AR缺失DM小鼠腎臟小球、小管、血管及間質(zhì)損傷,評(píng)估DN模型的建立。3.將野生型對(duì)照組、野生型糖尿病腎病組,A1AR-/-對(duì)照組與A1AR-/-糖尿病腎病組四組腎皮質(zhì)組織,提取RNA進(jìn)行mRNA基因芯片譜測(cè)序,篩選差異基因進(jìn)行KEGG通路聚類(lèi)分析,尋找A1AR參與DN損傷的可能分子通路。第二部分 A1AR在糖尿病腎病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的保護(hù)作用1.透射電鏡觀察DN小鼠腎間質(zhì)血管與周細(xì)胞的位置關(guān)系,免疫熒光染色觀察DN患者血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)、周細(xì)胞(PDGFRβ)及A1AR表達(dá)的位置關(guān)系;免疫組化染色評(píng)估腎小管管周毛細(xì)血管與周細(xì)胞損傷;免疫印跡法評(píng)估周齡野生型和A1AR-/-DN小鼠腎皮質(zhì)A1AR及A2AR的蛋白表達(dá)差異。觀察A1AR缺失對(duì)PTC及細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響,免疫組化染色半定量分析周細(xì)胞PDGFRβ、淋巴管podoplanin與炎癥巨噬細(xì)胞(F4/80)的關(guān)系。2.光鏡和電鏡觀察DN患者和小鼠病理特點(diǎn),利用免疫熒光染色對(duì)DN患者中A1AR與Megalin位置關(guān)系進(jìn)行定位,觀察DN患者和動(dòng)物近端小管Megalin與cubilin損傷與蛋白尿的關(guān)系;評(píng)估A1AR缺失對(duì)該病變的影響;3.常規(guī)病理染色評(píng)估DN小鼠腎臟纖維化及細(xì)胞外基質(zhì)沉積,利用免疫熒光雙觀察DN患者腎臟A1AR與膠原蛋白I的位置關(guān)系;免疫印跡法檢測(cè)A1AR缺失對(duì)Caspase1/IL18焦亡及NLRP3/IL1β炎癥小體信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平的影響,腎小管間質(zhì)促纖維化因子TGFβ及膠原蛋白(I/III/IV)的表達(dá)量變化,評(píng)估A1AR缺失DN小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)及纖維化的作用。第三部分 A1AR對(duì)高糖環(huán)境中近端小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制1.DMEM/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人近端小管上皮細(xì)胞系,至細(xì)胞80-90%融合時(shí),倒置顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征,免疫熒光常規(guī)行細(xì)胞鑒定(CK18,Megalin);2.高糖、等滲甘露醇和低糖分別與細(xì)胞共培養(yǎng)24h,免疫熒光檢測(cè)NLRP3,Caspase1/ICollagen1表達(dá)水平,評(píng)估高糖環(huán)境對(duì)近端小管上皮細(xì)胞的損傷作用。L18表達(dá),評(píng)估近端小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。72h收集細(xì)胞裂解液提取蛋白,western blot檢測(cè)小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物Megalin、緊密連接蛋白Occludin、巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子蛋白NLRP3/IL18、促纖維化因子TGFβ及膠原蛋白3.加入不同濃度的A1AR激動(dòng)劑(CCPA)或A1AR抑制劑(DPCPX)與細(xì)胞共孵育,CCK-8及LDH釋放試驗(yàn)方法分別檢測(cè)二者細(xì)胞增殖與毒性,選擇合適的濃度與高糖培養(yǎng)的細(xì)胞共孵育,Western blot檢測(cè)CCPA與DPCPX對(duì)近端小管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白(Occludin)、炎癥因子(NLRP3/Caspase1/IL18)及膠原蛋白Collagen1水平的變化。第四部分 A1AR在DN水鹽代謝異常相關(guān)高血壓中的調(diào)節(jié)作用1.觀察記錄DN患者及小鼠中血壓變化情況,免疫熒光染色確定DN患者中調(diào)節(jié)水鹽平衡轉(zhuǎn)運(yùn)子及調(diào)節(jié)激酶SGK1的表達(dá)部位(SGK1\NCC\NKCC2\SGLT2),免疫組化染色及半定量分析評(píng)估DN患者及小鼠腎臟各水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)子在DN中的表達(dá)情況;2.DN小鼠動(dòng)物模型中觀察A1AR-/-對(duì)血壓的影響,免疫組化染色及免疫印跡法評(píng)估 A1AR 缺失對(duì)水鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子調(diào)節(jié)酶 SGK1及各轉(zhuǎn)運(yùn)子(NCC\NKCC2\SGLT2\rENac)表達(dá)的影響。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(SPSS,Chicago,IL),符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn),自身前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);三組或以上比較使用單因素或多因素變量分析,采用雙側(cè)檢驗(yàn)的方法,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果第一部分 DN模型的確立及A1AR參與DN的分子通路初篩1.本研究納入13例DN患者,平均24h尿蛋白定量5.7±3.8g,平均血肌酐129.6±61.2umol/L,DN典型腎臟病理表現(xiàn)為腎小球及小管基底膜彌漫性增厚,K-W結(jié)節(jié)形成,血管壁增厚伴玻璃樣變,小管間質(zhì)局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。成功提取尿液外泌體,電鏡下呈典型雙膜結(jié)構(gòu)、平均直徑100nm(質(zhì)譜法),western blot法出檢測(cè)到外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101,及小管標(biāo)志物SGLT2、A1AR及NCC,提示尿液外泌體可以檢測(cè)到腎小管上轉(zhuǎn)運(yùn)子損傷。免疫熒光觀察到A1AR染色主要表達(dá)于近端小管上皮細(xì)胞。與GML組相比,DN患者腎小管A1AR表達(dá)增加約1.38倍。2.鏈脲佐菌素注射3天后檢測(cè)到野生型及A1AR-/-小鼠實(shí)驗(yàn)組血糖顯著升高,大于16.7mmol/L,持續(xù)16周,伴有多飲多食多尿,達(dá)到DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。腎臟重量顯著增加伴體重下降,24h尿白蛋白排泄率增加(129.4±12.2比16.7±2.5 μg/d,P0.001),光鏡及透射電鏡可觀察到腎小球與小管肥大、基底膜的顯著增厚,血管壁增厚與小管間質(zhì)纖維化,符合DN的特點(diǎn)。且A1AR-/-DN組較野生型WT-DN 組蛋白尿更多(183.8±9.7 比 129.4±12.2μg/d,P0.001);3.WT-Control,WT-DN,A1AR-/--Control 與 KO-DN 四組小鼠腎皮質(zhì)組織 mRNA基因芯片譜測(cè)序及差異基因KEGG通路富集分析結(jié)果提示:A1AR參與DN損傷主要分子機(jī)制涉及“細(xì)胞因子通路、蛋白內(nèi)吞通路與細(xì)胞外基質(zhì)沉積”;第二部分 A1AR在糖尿病腎病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的保護(hù)作用1.免疫熒光共染提示周細(xì)胞標(biāo)志物PDGFRβ表達(dá)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD34陽(yáng)性)外側(cè),在DN患者及小鼠動(dòng)物模型中觀察到周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離,PDGFRβ表達(dá)增加(24.5±0.6%比13.2±0.5%),伴有細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin及CD34表達(dá)下降(20.4±0.3%比27.6±0.2%)。腎小管間質(zhì)可見(jiàn)炎癥巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),提示糖尿病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞;2.A1AR在近端小管、血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)炎癥細(xì)胞上均有表達(dá),DN小鼠腎臟A1AR表達(dá)為對(duì)照組的1.38倍(P0.05)。A1AR-/-DN小鼠腎臟CD34缺失和緊密連接損害較 WT-DN 更重(CD34:0.3±0.03 比 0.6±0.08 比 1.0±0.05,P0.001;Occludin:0.4±0.06 比 0.7±0.04 比 1.0±0.03,P=009);3.免疫熒光結(jié)果提示近端小管上皮細(xì)胞上A1AR與megalin共表達(dá),透射電鏡觀察到隨著周齡的增加,DN小鼠近端小管刷狀緣側(cè)微絨毛結(jié)構(gòu)缺失。在DN患者和小鼠中觀察到megalin-cubilin損傷,與蛋白尿呈負(fù)性相關(guān)(DN患者r=-0.862,P=0002;DN小鼠r=-0.927,P0.001),損傷程度隨周齡增加而進(jìn)一步加重。同樣A1AR缺失進(jìn)一步加重DN小鼠megalin-cubilin損傷及蛋白尿;4.光鏡和電鏡下可觀察發(fā)現(xiàn)WT-DN小鼠腎小管間質(zhì)大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積和微絲狀結(jié)構(gòu),免疫組化TGFβ1與Collagen(I,III,IV)染色證實(shí)其膠原成分。western-blot檢測(cè)到焦亡相關(guān)Caspase1/IL18表達(dá)量增加;A1AR-/--DN小鼠中Caspase1/IL18 蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增加(1.52±0.6 比 1.24±0.3 比 1.0±0.2,P=0.017;1.51±0.3 比 1.3±0.2 比 1.0±0.2,P=0.018),小管間質(zhì)纖維化也進(jìn)一步加重。第三部分 A1AR對(duì)高糖環(huán)境中近端小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制1.倒置顯微鏡下單個(gè)近端小管上皮為多邊形或橢圓形,融合后呈鵝卵石樣鋪路石狀,免疫熒光染色可檢測(cè)到細(xì)胞CK18及megalin均呈陽(yáng)性,提示所培養(yǎng)細(xì)胞為腎臟近端小管上皮細(xì)胞;2.高糖共培養(yǎng)24h后,免疫熒光染色可觀察到巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和NLRP3/Caspase1/IL18表達(dá)。高糖共培養(yǎng)72h,免疫印跡檢測(cè)提示高糖組A1AR表達(dá)為對(duì)照組的1.8倍,相同滲透壓的甘露醇并不增加A1AR表達(dá)。同時(shí)刷狀緣Megalin(0.46±0.03 比 1.1±0.05,P=0.008)與緊密連接蛋白 Occludin(0.6±0.02 比 1.0±0.03,P=0.023)表達(dá)明顯降低,而NLRP3/IL18分別為對(duì)照組的4倍與2.5倍,伴有TGFβ表達(dá)量增加2倍;3.根據(jù)細(xì)胞增殖、毒性試驗(yàn)結(jié)果,選擇0.1ummol/L的CCPA(A1AR激動(dòng)劑)與0.1umol/L的DPCPX(A1AR抑制劑)分別與小管上皮細(xì)胞共孵育24h,western blot法證實(shí)CCPA可明顯抑制高糖環(huán)境誘導(dǎo)的炎癥因子NLRP3(0.4±0.03比1.0±0.06,P=0.032);Caspase-1(0.6±0.02 比 1.0±0.01,P=0.007),IL 18(0.7 ± 0.05 vs 1.0±0.04,P=0.045)水平,上調(diào)膠原蛋白 Collagenl(0.6±0.02 比 1.0±0.02,P=0.024)的表達(dá)。與此相反,A1AR抑制劑DPCPX可進(jìn)一步加重上述損傷。第四部分A1AR在DN水鹽代謝異常相關(guān)高血壓中的調(diào)節(jié)作用1.本研究納入的DN患者及DN小鼠均伴有高血壓的發(fā)生,免疫熒光顯示DN患者中腎臟NCC、NKCC2、SGLT2與rENac均表達(dá)于腎小管刷狀緣側(cè),免疫組化染色及半定量分析結(jié)果顯示與GML組相比,DN組NKCC2(1.6±0.3比1.0±0.2,P0.001)與 SGLT2(1.3±0.3 比 1.0±0.2,P=0.042)表達(dá)顯著增加,伴有調(diào)節(jié)激酶SGK1表達(dá)增加(1.32±0.2比1.0±0.3,P=0.041),而NCC表達(dá)無(wú)明顯差異;2.A1AR-/--DN 小鼠血壓更重(127±9.4 比 118±6.0 比 106±8.5 mmmHg,P0.001),免疫組化染色及western blot結(jié)果顯示A1AR缺失加重NCC(38 ±4.5比20±2.0 比 10±0.6%,P0.001)、NKCC2(36±5.2 比 20±2.3 比 16±0.8%,P0.001)與 rENac(1.32±0.1 比 0.8±0.3 比 1.0±0.1,P=0.02)表達(dá)上調(diào),而A1AR缺失后水鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子調(diào)節(jié)酶SGK1表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)論本研究條件下1.A1AR在糖尿病腎小管、小管周毛細(xì)血管-周細(xì)胞及間質(zhì)組成的腎小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)損傷中具有保護(hù)作用;2.A1AR缺失導(dǎo)致局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的炎癥反應(yīng)(Caspase1/IL18),加重腎小管megalin損傷相關(guān)蛋白尿,以及周細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞分離誘導(dǎo)的小管間質(zhì)纖維化;3.A1AR激動(dòng)劑有助于改善該微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng),減輕上述病理生理過(guò)程,與之相反A1AR抑制劑會(huì)進(jìn)一步加重此損傷;4.DN及小鼠血壓升高與腎臟水鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)異常相關(guān),A1AR缺失小鼠血壓更高,A1AR主要通過(guò)調(diào)節(jié)管球反饋參與水鈉平衡及血壓的調(diào)節(jié),與SGK1無(wú)關(guān)。
【圖文】：

圖１．研究機(jī)制假說(shuō)圖逡逑

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研宄生論文光，滴加一抗后行４°Ｃ孵育過(guò)夜或３７°Ｃ孵育１小時(shí)；后滴加二抗３７°Ｃ小時(shí)，需注意：加二抗后每一步均需在避光條件下進(jìn)行，二抗孵育后滴染液染核５分鐘（藍(lán)色熒光）；完成以上步驟后滴加防熒光淬滅劑蓋玻ｅｉｃａ共聚焦顯微鏡下觀察拍照。逡逑液外泌體提取逡逑液標(biāo)本留�。荷衔纾福海埃埃保埃海埃爸g（午餐前ｌ－２ｈ）留取清晨第二次尿（０ｍｌ），立即凍存于－８０°Ｃ備用。逡逑液外泌體分離：采用超速離心法，，具體步驟如下（圖１．１），最后以５０ＭＬＰＢＳ溶解沉淀得到外泌體混合液。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 熱孜萬(wàn)古力·阿帕爾;吳紅;;2型糖尿病腎病患者檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶-10的意義[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2016年03期

2 王超;;高頻超聲評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)率對(duì)2型糖尿病腎病患者頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度及頸動(dòng)脈粥樣硬化血管重構(gòu)的影響[J];中國(guó)醫(yī)療器械信息;2019年21期

3 王小星;;糖通飲聯(lián)合羥苯磺酸鈣治療2型糖尿病腎病早期療效觀察[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師;2019年32期

4 張帥;殷國(guó)泉;于春曉;高羽;徐嬌陽(yáng);秦明明;路勇;浦春;;超氧化物歧化酶檢測(cè)輔助診斷2型糖尿病腎病[J];牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2019年06期

5 胡曉蓉;;糖尿病病人常見(jiàn)的飲食、運(yùn)動(dòng)誤區(qū)[J];中國(guó)水電醫(yī)學(xué);2006年06期

6 趙玉馨;;糖尿病腎病61例臨床分析[J];水電醫(yī)學(xué)雜志;1995年01期

7 鄭潔;;糖尿病腎病易患因素分析[J];中國(guó)水電醫(yī)學(xué);2003年02期

8 嚴(yán)海桑;;中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病腎病[J];保健文匯;2019年11期

9 戴寧;張煜;馬捷;吳鳳芝;李傅堯;張睿;于姣姣;張煒悅;林炳岐;孫天石;張蔚;劉夢(mèng);李峰;;糖尿病腎病的中醫(yī)治療近況[J];吉林中醫(yī)藥;2018年12期

10 姜雪剛;韓春芳;;糖尿病腎病患者的預(yù)防與保健[J];中外女性健康研究;2019年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姜Z腪

本文編號(hào)：2710839