【摘要】：研究背景糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)作為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,是導致終末期腎病(End Stage Renal Disease,ESRD)的重要原因。越來越多的證據顯示腎小管間質病變是DN發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素。因此,研究糖尿病時腎小管、腎小管周毛細血管(Peritubular Capillary,PTC)及間質微環(huán)境改變的機制和效應,有助于尋找治療DN新的干預位點。腺苷1型受體(A1 Adenosine Receptor,A1AR)在腎臟廣泛表達,因其在腎臟管球反饋(Tubulo-glomerular Feedback,TGF)中的重要調控作用而受到廣泛關注,我們前期研究觀察到DN時,A1AR基因敲除,加重DN但與TGF無關。而在造影劑腎病和缺血再灌注動物模型中,觀察到A1AR存在不依賴于管球反饋的腎臟保護作用,DN時是否存在相似的情況,具體機制并不清楚。研究目的本研究將通過DN患者、A1AR基因敲除(A1AR-/-)DN小鼠動物模型和體外細胞實驗,從組織器官、細胞和分子水平觀察A1AR缺失對于DN腎小管周微環(huán)境(腎小管、間質和腎小管周毛細血管)非依賴于管球反饋的損傷機制,了解激活A1AR對蛋白尿發(fā)生和腎臟纖維化機制的保護作用。1.建立A1AR缺失DN小鼠動物模型,通過腎臟mRNA基因芯片譜檢測篩選差異表達基因,尋找A1AR參與DN發(fā)展的可能分子調節(jié)通路;2.在DN患者、小鼠模型中觀察A1AR缺失加重腎小管周微環(huán)境損傷,保護刷狀緣轉運蛋白Megalin破壞和小管間質纖維化的可能機制;3.體外細胞培養(yǎng)驗證A1AR對高糖環(huán)境下近端小管上皮細胞損傷的保護作用;進而為DN防治提供新的思路和潛在的干預位點;4.觀察A1AR在DN水鹽代謝相關高血壓中的調節(jié)作用及可能機制。研究方法第一部分 DN模型的確立及A1AR參與DN的分子通路初篩1.納入腎活檢證實為糖尿病腎病患者,年齡性別匹配的腎小球輕微病變作為對照組,分析其臨床病理特點,收集患者尿液提取外泌體進行形態(tài)、粒徑及標志物的鑒定,免疫印跡法檢測尿外泌體中A1AR及SGLT2蛋白;免疫熒光染色確定A1AR在DN患者腎臟的表達部位,免疫組化及半定量分析評估DN患者和動物A1AR與對照組的表達差異。2.分別在C57/BL野生型及管球反饋缺失的A1AR-/-小鼠中,通過腹腔注射鏈脲佐菌素120mg/kg建立1型DM動物模型,選擇不同時間點,血糖試紙檢測血糖、代謝籠留取24h尿標本、尾夾法監(jiān)測血壓;觀察體重、血糖及尿量的變化,檢測尿白蛋白水平;常規(guī)病理染色及透射電鏡觀察野生型及A1AR缺失DM小鼠腎臟小球、小管、血管及間質損傷,評估DN模型的建立。3.將野生型對照組、野生型糖尿病腎病組,A1AR-/-對照組與A1AR-/-糖尿病腎病組四組腎皮質組織,提取RNA進行mRNA基因芯片譜測序,篩選差異基因進行KEGG通路聚類分析,尋找A1AR參與DN損傷的可能分子通路。第二部分 A1AR在糖尿病腎病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的保護作用1.透射電鏡觀察DN小鼠腎間質血管與周細胞的位置關系,免疫熒光染色觀察DN患者血管內皮細胞(CD34)、周細胞(PDGFRβ)及A1AR表達的位置關系;免疫組化染色評估腎小管管周毛細血管與周細胞損傷;免疫印跡法評估周齡野生型和A1AR-/-DN小鼠腎皮質A1AR及A2AR的蛋白表達差異。觀察A1AR缺失對PTC及細胞緊密連接蛋白表達的影響,免疫組化染色半定量分析周細胞PDGFRβ、淋巴管podoplanin與炎癥巨噬細胞(F4/80)的關系。2.光鏡和電鏡觀察DN患者和小鼠病理特點,利用免疫熒光染色對DN患者中A1AR與Megalin位置關系進行定位,觀察DN患者和動物近端小管Megalin與cubilin損傷與蛋白尿的關系;評估A1AR缺失對該病變的影響;3.常規(guī)病理染色評估DN小鼠腎臟纖維化及細胞外基質沉積,利用免疫熒光雙觀察DN患者腎臟A1AR與膠原蛋白I的位置關系;免疫印跡法檢測A1AR缺失對Caspase1/IL18焦亡及NLRP3/IL1β炎癥小體信號通路蛋白的表達水平的影響,腎小管間質促纖維化因子TGFβ及膠原蛋白(I/III/IV)的表達量變化,評估A1AR缺失DN小管間質炎癥反應及纖維化的作用。第三部分 A1AR對高糖環(huán)境中近端小管上皮細胞損傷的保護機制1.DMEM/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人近端小管上皮細胞系,至細胞80-90%融合時,倒置顯微鏡觀察其形態(tài)學特征,免疫熒光常規(guī)行細胞鑒定(CK18,Megalin);2.高糖、等滲甘露醇和低糖分別與細胞共培養(yǎng)24h,免疫熒光檢測NLRP3,Caspase1/ICollagen1表達水平,評估高糖環(huán)境對近端小管上皮細胞的損傷作用。L18表達,評估近端小管上皮細胞炎癥反應。72h收集細胞裂解液提取蛋白,western blot檢測小管上皮細胞標志物Megalin、緊密連接蛋白Occludin、巨噬細胞分泌的炎癥因子蛋白NLRP3/IL18、促纖維化因子TGFβ及膠原蛋白3.加入不同濃度的A1AR激動劑(CCPA)或A1AR抑制劑(DPCPX)與細胞共孵育,CCK-8及LDH釋放試驗方法分別檢測二者細胞增殖與毒性,選擇合適的濃度與高糖培養(yǎng)的細胞共孵育,Western blot檢測CCPA與DPCPX對近端小管上皮細胞緊密連接蛋白(Occludin)、炎癥因子(NLRP3/Caspase1/IL18)及膠原蛋白Collagen1水平的變化。第四部分 A1AR在DN水鹽代謝異常相關高血壓中的調節(jié)作用1.觀察記錄DN患者及小鼠中血壓變化情況,免疫熒光染色確定DN患者中調節(jié)水鹽平衡轉運子及調節(jié)激酶SGK1的表達部位(SGK1\NCC\NKCC2\SGLT2),免疫組化染色及半定量分析評估DN患者及小鼠腎臟各水鈉轉運子在DN中的表達情況;2.DN小鼠動物模型中觀察A1AR-/-對血壓的影響,免疫組化染色及免疫印跡法評估 A1AR 缺失對水鹽轉運子調節(jié)酶 SGK1及各轉運子(NCC\NKCC2\SGLT2\rENac)表達的影響。統(tǒng)計方法采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析(SPSS,Chicago,IL),符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗,自身前后比較采用配對t檢驗;三組或以上比較使用單因素或多因素變量分析,采用雙側檢驗的方法,P0.05為有統(tǒng)計學意義。研究結果第一部分 DN模型的確立及A1AR參與DN的分子通路初篩1.本研究納入13例DN患者,平均24h尿蛋白定量5.7±3.8g,平均血肌酐129.6±61.2umol/L,DN典型腎臟病理表現為腎小球及小管基底膜彌漫性增厚,K-W結節(jié)形成,血管壁增厚伴玻璃樣變,小管間質局灶性炎細胞浸潤及纖維化。成功提取尿液外泌體,電鏡下呈典型雙膜結構、平均直徑100nm(質譜法),western blot法出檢測到外泌體標志性蛋白TSG101,及小管標志物SGLT2、A1AR及NCC,提示尿液外泌體可以檢測到腎小管上轉運子損傷。免疫熒光觀察到A1AR染色主要表達于近端小管上皮細胞。與GML組相比,DN患者腎小管A1AR表達增加約1.38倍。2.鏈脲佐菌素注射3天后檢測到野生型及A1AR-/-小鼠實驗組血糖顯著升高,大于16.7mmol/L,持續(xù)16周,伴有多飲多食多尿,達到DM診斷標準。腎臟重量顯著增加伴體重下降,24h尿白蛋白排泄率增加(129.4±12.2比16.7±2.5 μg/d,P0.001),光鏡及透射電鏡可觀察到腎小球與小管肥大、基底膜的顯著增厚,血管壁增厚與小管間質纖維化,符合DN的特點。且A1AR-/-DN組較野生型WT-DN 組蛋白尿更多(183.8±9.7 比 129.4±12.2μg/d,P0.001);3.WT-Control,WT-DN,A1AR-/--Control 與 KO-DN 四組小鼠腎皮質組織 mRNA基因芯片譜測序及差異基因KEGG通路富集分析結果提示:A1AR參與DN損傷主要分子機制涉及“細胞因子通路、蛋白內吞通路與細胞外基質沉積”;第二部分 A1AR在糖尿病腎病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的保護作用1.免疫熒光共染提示周細胞標志物PDGFRβ表達在微血管內皮細胞(CD34陽性)外側,在DN患者及小鼠動物模型中觀察到周細胞與血管內皮細胞的分離,PDGFRβ表達增加(24.5±0.6%比13.2±0.5%),伴有細胞緊密連接蛋白Occludin及CD34表達下降(20.4±0.3%比27.6±0.2%)。腎小管間質可見炎癥巨噬細胞浸潤,提示糖尿病小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞;2.A1AR在近端小管、血管內皮細胞及間質炎癥細胞上均有表達,DN小鼠腎臟A1AR表達為對照組的1.38倍(P0.05)。A1AR-/-DN小鼠腎臟CD34缺失和緊密連接損害較 WT-DN 更重(CD34:0.3±0.03 比 0.6±0.08 比 1.0±0.05,P0.001;Occludin:0.4±0.06 比 0.7±0.04 比 1.0±0.03,P=009);3.免疫熒光結果提示近端小管上皮細胞上A1AR與megalin共表達,透射電鏡觀察到隨著周齡的增加,DN小鼠近端小管刷狀緣側微絨毛結構缺失。在DN患者和小鼠中觀察到megalin-cubilin損傷,與蛋白尿呈負性相關(DN患者r=-0.862,P=0002;DN小鼠r=-0.927,P0.001),損傷程度隨周齡增加而進一步加重。同樣A1AR缺失進一步加重DN小鼠megalin-cubilin損傷及蛋白尿;4.光鏡和電鏡下可觀察發(fā)現WT-DN小鼠腎小管間質大量細胞外基質沉積和微絲狀結構,免疫組化TGFβ1與Collagen(I,III,IV)染色證實其膠原成分。western-blot檢測到焦亡相關Caspase1/IL18表達量增加;A1AR-/--DN小鼠中Caspase1/IL18 蛋白表達量進一步增加(1.52±0.6 比 1.24±0.3 比 1.0±0.2,P=0.017;1.51±0.3 比 1.3±0.2 比 1.0±0.2,P=0.018),小管間質纖維化也進一步加重。第三部分 A1AR對高糖環(huán)境中近端小管上皮細胞損傷的保護機制1.倒置顯微鏡下單個近端小管上皮為多邊形或橢圓形,融合后呈鵝卵石樣鋪路石狀,免疫熒光染色可檢測到細胞CK18及megalin均呈陽性,提示所培養(yǎng)細胞為腎臟近端小管上皮細胞;2.高糖共培養(yǎng)24h后,免疫熒光染色可觀察到巨噬細胞標志物CD68和NLRP3/Caspase1/IL18表達。高糖共培養(yǎng)72h,免疫印跡檢測提示高糖組A1AR表達為對照組的1.8倍,相同滲透壓的甘露醇并不增加A1AR表達。同時刷狀緣Megalin(0.46±0.03 比 1.1±0.05,P=0.008)與緊密連接蛋白 Occludin(0.6±0.02 比 1.0±0.03,P=0.023)表達明顯降低,而NLRP3/IL18分別為對照組的4倍與2.5倍,伴有TGFβ表達量增加2倍;3.根據細胞增殖、毒性試驗結果,選擇0.1ummol/L的CCPA(A1AR激動劑)與0.1umol/L的DPCPX(A1AR抑制劑)分別與小管上皮細胞共孵育24h,western blot法證實CCPA可明顯抑制高糖環(huán)境誘導的炎癥因子NLRP3(0.4±0.03比1.0±0.06,P=0.032);Caspase-1(0.6±0.02 比 1.0±0.01,P=0.007),IL 18(0.7 ± 0.05 vs 1.0±0.04,P=0.045)水平,上調膠原蛋白 Collagenl(0.6±0.02 比 1.0±0.02,P=0.024)的表達。與此相反,A1AR抑制劑DPCPX可進一步加重上述損傷。第四部分A1AR在DN水鹽代謝異常相關高血壓中的調節(jié)作用1.本研究納入的DN患者及DN小鼠均伴有高血壓的發(fā)生,免疫熒光顯示DN患者中腎臟NCC、NKCC2、SGLT2與rENac均表達于腎小管刷狀緣側,免疫組化染色及半定量分析結果顯示與GML組相比,DN組NKCC2(1.6±0.3比1.0±0.2,P0.001)與 SGLT2(1.3±0.3 比 1.0±0.2,P=0.042)表達顯著增加,伴有調節(jié)激酶SGK1表達增加(1.32±0.2比1.0±0.3,P=0.041),而NCC表達無明顯差異;2.A1AR-/--DN 小鼠血壓更重(127±9.4 比 118±6.0 比 106±8.5 mmmHg,P0.001),免疫組化染色及western blot結果顯示A1AR缺失加重NCC(38 ±4.5比20±2.0 比 10±0.6%,P0.001)、NKCC2(36±5.2 比 20±2.3 比 16±0.8%,P0.001)與 rENac(1.32±0.1 比 0.8±0.3 比 1.0±0.1,P=0.02)表達上調,而A1AR缺失后水鹽轉運子調節(jié)酶SGK1表達量無明顯變化。結論本研究條件下1.A1AR在糖尿病腎小管、小管周毛細血管-周細胞及間質組成的腎小管周微環(huán)境穩(wěn)態(tài)損傷中具有保護作用;2.A1AR缺失導致局部巨噬細胞浸潤相關的炎癥反應(Caspase1/IL18),加重腎小管megalin損傷相關蛋白尿,以及周細胞與血管內皮細胞分離誘導的小管間質纖維化;3.A1AR激動劑有助于改善該微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和炎癥反應,減輕上述病理生理過程,與之相反A1AR抑制劑會進一步加重此損傷;4.DN及小鼠血壓升高與腎臟水鹽轉運子表達異常相關,A1AR缺失小鼠血壓更高,A1AR主要通過調節(jié)管球反饋參與水鈉平衡及血壓的調節(jié),與SGK1無關。
【圖文】：

圖１．研究機制假說圖逡逑

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院博士研宄生論文光，滴加一抗后行４°Ｃ孵育過夜或３７°Ｃ孵育１小時；后滴加二抗３７°Ｃ小時，需注意：加二抗后每一步均需在避光條件下進行，二抗孵育后滴染液染核５分鐘（藍色熒光）；完成以上步驟后滴加防熒光淬滅劑蓋玻ｅｉｃａ共聚焦顯微鏡下觀察拍照。逡逑液外泌體提取逡逑液標本留取：上午８：００－１０：００之間（午餐前ｌ－２ｈ）留取清晨第二次尿（０ｍｌ），立即凍存于－８０°Ｃ備用。逡逑液外泌體分離：采用超速離心法，，具體步驟如下（圖１．１），最后以５０ＭＬＰＢＳ溶解沉淀得到外泌體混合液。逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 熱孜萬古力·阿帕爾;吳紅;;2型糖尿病腎病患者檢測血清基質金屬蛋白酶-10的意義[J];現代檢驗醫(yī)學雜志;2016年03期

2 王超;;高頻超聲評價腎小球濾過率對2型糖尿病腎病患者頸動脈內-中膜厚度及頸動脈粥樣硬化血管重構的影響[J];中國醫(yī)療器械信息;2019年21期

3 王小星;;糖通飲聯合羥苯磺酸鈣治療2型糖尿病腎病早期療效觀察[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2019年32期

4 張帥;殷國泉;于春曉;高羽;徐嬌陽;秦明明;路勇;浦春;;超氧化物歧化酶檢測輔助診斷2型糖尿病腎病[J];牡丹江醫(yī)學院學報;2019年06期

5 胡曉蓉;;糖尿病病人常見的飲食、運動誤區(qū)[J];中國水電醫(yī)學;2006年06期

6 趙玉馨;;糖尿病腎病61例臨床分析[J];水電醫(yī)學雜志;1995年01期

7 鄭潔;;糖尿病腎病易患因素分析[J];中國水電醫(yī)學;2003年02期

8 嚴海桑;;中西醫(yī)結合治療糖尿病腎病[J];保健文匯;2019年11期

9 戴寧;張煜;馬捷;吳鳳芝;李傅堯;張睿;于姣姣;張煒悅;林炳岐;孫天石;張蔚;劉夢;李峰;;糖尿病腎病的中醫(yī)治療近況[J];吉林中醫(yī)藥;2018年12期

10 姜雪剛;韓春芳;;糖尿病腎病患者的預防與保健[J];中外女性健康研究;2019年01期

相關會議論文 前10條

1 姜Z腪

本文編號：2710839