【摘要】：研究背景:膀胱癌被報(bào)道是全身的十大常見腫瘤中之一,也是泌尿系統(tǒng)疾病中最常見的惡性腫瘤,在我國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率占第一位。近幾年隨著各種不同的治療手段的不斷進(jìn)步,各種手術(shù)方式及藥物的應(yīng)用使得膀胱癌的治療策略越來越豐富,但是患有膀胱癌的患者的預(yù)后情況仍然不樂觀,患者的5年存活率并沒有得到顯著的提高。膀胱腫瘤的病理類型主要為尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌,以及罕見病理分類如小細(xì)胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及轉(zhuǎn)移性癌等。其中,絕大部分的膀胱腫瘤為尿路上皮癌,尿路上皮癌的發(fā)病率占所有膀胱腫瘤的90%。然而,至今其發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚,因此,研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)于找到膀胱癌新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。瞬時(shí)感受器電位(Transient receptor potential,TRP)超家族是最早被發(fā)現(xiàn)于果蠅的視覺系統(tǒng)中的一類非選擇性陽(yáng)離子通道家族,廣泛分布于低等及高等生物中,目前已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)成員。依其結(jié)構(gòu)同源性可分為TRPC(canonical)、TRPV(vanilloid)、TRPM(melastatin)、TRPA(ankyrin transmembrane protein)、TRPML(mucolipin)、TRPP(polycystin)、TRPN(nompC-like)7個(gè)不同的亞家族,每一亞家族又由若干成員組成。TRPV是其中最大、最多樣化的重要亞家族,包括:TRPV1-6六個(gè)成員,可參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。瞬時(shí)感受器電位香草醛受體亞型4(TRPV4)于消化、呼吸、心血管等系統(tǒng)中廣泛表達(dá),TRPV4通道參與多種生理及病理過程,在功能上,TRPV4通道可被溫度、剪切力、滲透壓等刺激激活,以此參與對(duì)機(jī)體生理功能的調(diào)控。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)多種TRP通道(TRRPV1,TRPM8,TRPC6等)的異常表達(dá)在促進(jìn)或抑制多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,TRP通道逐漸成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。但TRPV4在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮的作用鮮有報(bào)道,TRPV4在膀胱粘膜上皮有豐富的表達(dá),生理情況下主要參與膀胱的機(jī)械感受,通道被激活后首先引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,細(xì)胞內(nèi)鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使,有研究表明,鈣信號(hào)的改變參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,因此,我們假設(shè)TRPV4通道異常表達(dá)可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。研究目的:通過比較TRPV4通道在正常膀胱上皮細(xì)胞及膀胱癌細(xì)胞系中的功能及蛋白表達(dá)差異,探究TRPV4在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用。研究方法:體外培養(yǎng)人正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1,人膀胱癌5637,T24,J82,SW1710細(xì)胞系。在熒光顯微鏡下利用鈣成像方法,以TRPV4通道激動(dòng)劑GSK 1016790A激活TRPV4通道,記錄這五種細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流幅度及出現(xiàn)反應(yīng)的細(xì)胞百分比,制作劑量效應(yīng)曲線,得出半最效應(yīng)濃度(EC50)及最大反應(yīng)幅度值(Max)并比較各細(xì)胞系EC50及Max的區(qū)別,從而觀察TRPV4通道功能表達(dá)的差異。以ATP激活尿路上皮嘌呤受體,觀察記錄這五種細(xì)胞系細(xì)胞活性有無差別。用免疫組化的方法觀察在這五種細(xì)胞系及人膀胱癌旁組織與腫瘤組織中的TRPV4通道蛋白表達(dá)情況及差異。以方差分析及Dunn's檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞系GSK引起的鈣離子升高幅度的差異;以卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)對(duì)GSK出現(xiàn)反應(yīng)的細(xì)胞百分比的差異。研究結(jié)果:細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示:在人正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1及4種膀胱癌細(xì)胞系均可見各細(xì)胞均呈多邊形生長(zhǎng),這提示了細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了分化,且形態(tài)上無明顯差異。鈣成像結(jié)果顯示:GSK對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞系5637及T24細(xì)胞均引起了濃度依賴性的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,EC50分別為38.25nM,1.29nM,0.97nM;鈣內(nèi)流最大幅度分別為1.39±0.02,0.40±0.08,0.63±0.03。但在膀胱癌細(xì)胞系SW1710及J82中任何濃度GSK刺激時(shí)均無細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高,無法計(jì)算EC50及Max。以單一濃度30nMGSK刺激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高幅度進(jìn)行比較時(shí),發(fā)現(xiàn)正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流升高幅度明顯高于膀胱癌細(xì)胞系5637及T24,細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流最大升高幅度分別為1.07±0.07,0.37±0.04及0.60±0.12,膀胱癌細(xì)胞系J82及SW1710無細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無變化,正常細(xì)胞系與其它四種癌細(xì)胞系相比有明顯差異(方差分析檢驗(yàn),P0.01),正常細(xì)胞系與其他各細(xì)胞系兩兩比較均顯示差異(P均小于0.01);在30nMGSK刺激時(shí),人正常上皮細(xì)胞系SV-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞系5637、T24、SW1710及J82細(xì)胞發(fā)生鈣內(nèi)流反應(yīng)的細(xì)胞百分比分別為52.20%,1%,25%,0及0,正常細(xì)胞系與其它四種癌細(xì)胞系相比有明顯差異(卡方檢驗(yàn),P0.01)。以對(duì)ATP反應(yīng)作為衡量細(xì)胞活性的指標(biāo),結(jié)果顯示各細(xì)胞系對(duì)100uMATP的反應(yīng)無明顯差別(P0.05),證明各細(xì)胞對(duì)GSK引起的鈣內(nèi)流差異非細(xì)胞活性差別引起。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:這五種細(xì)胞系TRPV4通道受體蛋白均有不同程度的表達(dá),但是與正常膀胱上皮細(xì)胞系SV-HUC-1相比,膀胱癌細(xì)胞系表達(dá)強(qiáng)度較弱,說明了在膀胱癌細(xì)胞系中TRPV4通道受體的蛋白表達(dá)較正常膀胱上皮細(xì)胞系降低。同時(shí)我們也進(jìn)行了人膀胱癌旁組織與人腫瘤組織TRPV4通道蛋白表達(dá)情況的比較,也得到了相同的結(jié)果。研究結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四種膀胱癌細(xì)胞系的TRPV4通道無論在功能表達(dá)水平還是蛋白表達(dá)水平均較正常膀胱上皮細(xì)胞系降低,提示TRPV4可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用,TRPV4通道可能成為未來治療膀胱癌的靶點(diǎn)。
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑３．結(jié)邋果逡逑３．１邋．細(xì)胞系形態(tài)的比較逡逑下圖各細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)光鏡圖片，我們由圖可見在人正常膀胱上皮細(xì)胞系逡逑ＳＶ－ＨＵＣ－１及４種膀胱癌細(xì)胞系均可見各細(xì)胞均呈多邊形生長(zhǎng)，這提示了細(xì)胞已逡逑經(jīng)進(jìn)行了分化，且形態(tài)上無明顯差異。逡逑

為進(jìn)？步顯示各個(gè)細(xì)胞系對(duì)ＧＳＫ刺激的差異，選S謂詠０螂咨掀は赴義舷檔模�？有效浓洱x牛茫擔(dān)板澹ǎ常埃睿停┳魑冉希抵窒赴擋鉅斕謀曜�。在３０ｎF(tuán)ǘ鵲膩義希牽櫻舜碳五種細(xì)胞系鈣離Ｔ變化劑貴效應(yīng)關(guān)系如圖５Ａ，，細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流最逡逑大升高幅度在正常膀胱上皮細(xì)胞系ＳＶ－ＨＵＣ－１、膀胱癌細(xì)胞系５６３７、Ｔ２４中別為逡逑１．０７±０．０７，０．３７±０．０４邋及邋０．６０＊０．１２，而邋ＧＳＫ邋１０１６７９０Ａ邋在邋Ｊ８２邋及邋ＳＷ１７１０邋膀胱癌逡逑細(xì)胞系未引起胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，正常細(xì)胞系與其它四種癌細(xì)胞系相比有明逡逑顯差異，經(jīng)方差分析檢驗(yàn)，Ｐ＜０．０１，，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常細(xì)胞系與其他各細(xì)逡逑胞系兩兩比較均顯示差異（Ｐ均小于０．０１）。細(xì)胞發(fā)生鈣內(nèi)流反應(yīng)的細(xì)胞百分比逡逑在人正常上皮細(xì)胞系ＳＶ－ＨＵＣ－丨、膀胱癌細(xì)胞系５６３７、Ｔ２４、ＳＷ１７１０及Ｊ８２細(xì)逡逑胞中分別為５２．２０％，邋１％，邋２５％，邋０及０，與細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化幅度結(jié)果一致，經(jīng)逡逑卡方檢驗(yàn)，ＰＣ０．０１，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表２）。各細(xì)胞系間幅度的比較可見正常逡逑膀胱上皮細(xì)胞系升高幅度較大（圖５Ｂ）。各細(xì)胞系百分比的比較與鈣內(nèi)流升高逡逑幅度結(jié)果相同（圖５Ｃ）。因此我們的實(shí)驗(yàn)表明ＴＲＰＶ４通道受體在激動(dòng)劑３０ｎＭ逡逑ＧＳＫ的刺激T，正常膀胱上皮細(xì)胞系較膀胱癌細(xì)胞系發(fā)生鈣內(nèi)流細(xì)胞數(shù)量更多，逡逑鈣內(nèi)流幅度更大，且Ｐ＜０．０１，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑２３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2707884