【摘要】：研究背景:膀胱癌被報道是全身的十大常見腫瘤中之一,也是泌尿系統(tǒng)疾病中最常見的惡性腫瘤,在我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率占第一位。近幾年隨著各種不同的治療手段的不斷進步,各種手術方式及藥物的應用使得膀胱癌的治療策略越來越豐富,但是患有膀胱癌的患者的預后情況仍然不樂觀,患者的5年存活率并沒有得到顯著的提高。膀胱腫瘤的病理類型主要為尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、腺癌,以及罕見病理分類如小細胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及轉移性癌等。其中,絕大部分的膀胱腫瘤為尿路上皮癌,尿路上皮癌的發(fā)病率占所有膀胱腫瘤的90%。然而,至今其發(fā)生發(fā)展的相關機制尚未完全清楚,因此,研究其發(fā)生發(fā)展機制對于找到膀胱癌新的治療靶點至關重要。瞬時感受器電位(Transient receptor potential,TRP)超家族是最早被發(fā)現(xiàn)于果蠅的視覺系統(tǒng)中的一類非選擇性陽離子通道家族,廣泛分布于低等及高等生物中,目前已發(fā)現(xiàn)30多個成員。依其結構同源性可分為TRPC(canonical)、TRPV(vanilloid)、TRPM(melastatin)、TRPA(ankyrin transmembrane protein)、TRPML(mucolipin)、TRPP(polycystin)、TRPN(nompC-like)7個不同的亞家族,每一亞家族又由若干成員組成。TRPV是其中最大、最多樣化的重要亞家族,包括:TRPV1-6六個成員,可參與多種細胞功能的調節(jié)。瞬時感受器電位香草醛受體亞型4(TRPV4)于消化、呼吸、心血管等系統(tǒng)中廣泛表達,TRPV4通道參與多種生理及病理過程,在功能上,TRPV4通道可被溫度、剪切力、滲透壓等刺激激活,以此參與對機體生理功能的調控。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)多種TRP通道(TRRPV1,TRPM8,TRPC6等)的異常表達在促進或抑制多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,TRP通道逐漸成為腫瘤研究的熱點。但TRPV4在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮的作用鮮有報道,TRPV4在膀胱粘膜上皮有豐富的表達,生理情況下主要參與膀胱的機械感受,通道被激活后首先引起細胞內鈣離子升高,細胞內鈣離子是重要的細胞內第二信使,有研究表明,鈣信號的改變參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,因此,我們假設TRPV4通道異常表達可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。研究目的:通過比較TRPV4通道在正常膀胱上皮細胞及膀胱癌細胞系中的功能及蛋白表達差異,探究TRPV4在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用。研究方法:體外培養(yǎng)人正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1,人膀胱癌5637,T24,J82,SW1710細胞系。在熒光顯微鏡下利用鈣成像方法,以TRPV4通道激動劑GSK 1016790A激活TRPV4通道,記錄這五種細胞系細胞內鈣離子內流幅度及出現(xiàn)反應的細胞百分比,制作劑量效應曲線,得出半最效應濃度(EC50)及最大反應幅度值(Max)并比較各細胞系EC50及Max的區(qū)別,從而觀察TRPV4通道功能表達的差異。以ATP激活尿路上皮嘌呤受體,觀察記錄這五種細胞系細胞活性有無差別。用免疫組化的方法觀察在這五種細胞系及人膀胱癌旁組織與腫瘤組織中的TRPV4通道蛋白表達情況及差異。以方差分析及Dunn's檢驗統(tǒng)計各細胞系GSK引起的鈣離子升高幅度的差異;以卡方檢驗統(tǒng)計對GSK出現(xiàn)反應的細胞百分比的差異。研究結果:細胞培養(yǎng)結果顯示:在人正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1及4種膀胱癌細胞系均可見各細胞均呈多邊形生長,這提示了細胞已經進行了分化,且形態(tài)上無明顯差異。鈣成像結果顯示:GSK對正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1、膀胱癌細胞系5637及T24細胞均引起了濃度依賴性的細胞內鈣離子升高,EC50分別為38.25nM,1.29nM,0.97nM;鈣內流最大幅度分別為1.39±0.02,0.40±0.08,0.63±0.03。但在膀胱癌細胞系SW1710及J82中任何濃度GSK刺激時均無細胞內鈣離子升高,無法計算EC50及Max。以單一濃度30nMGSK刺激引起的細胞內鈣離子升高幅度進行比較時,發(fā)現(xiàn)正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1細胞內鈣離子內流升高幅度明顯高于膀胱癌細胞系5637及T24,細胞內鈣離子內流最大升高幅度分別為1.07±0.07,0.37±0.04及0.60±0.12,膀胱癌細胞系J82及SW1710無細胞內鈣離子濃度無變化,正常細胞系與其它四種癌細胞系相比有明顯差異(方差分析檢驗,P0.01),正常細胞系與其他各細胞系兩兩比較均顯示差異(P均小于0.01);在30nMGSK刺激時,人正常上皮細胞系SV-HUC-1、膀胱癌細胞系5637、T24、SW1710及J82細胞發(fā)生鈣內流反應的細胞百分比分別為52.20%,1%,25%,0及0,正常細胞系與其它四種癌細胞系相比有明顯差異(卡方檢驗,P0.01)。以對ATP反應作為衡量細胞活性的指標,結果顯示各細胞系對100uMATP的反應無明顯差別(P0.05),證明各細胞對GSK引起的鈣內流差異非細胞活性差別引起。免疫組化實驗結果顯示:這五種細胞系TRPV4通道受體蛋白均有不同程度的表達,但是與正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1相比,膀胱癌細胞系表達強度較弱,說明了在膀胱癌細胞系中TRPV4通道受體的蛋白表達較正常膀胱上皮細胞系降低。同時我們也進行了人膀胱癌旁組織與人腫瘤組織TRPV4通道蛋白表達情況的比較,也得到了相同的結果。研究結論:實驗結果表明四種膀胱癌細胞系的TRPV4通道無論在功能表達水平還是蛋白表達水平均較正常膀胱上皮細胞系降低,提示TRPV4可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用,TRPV4通道可能成為未來治療膀胱癌的靶點。
【圖文】：

邐山東大學碩士學位論文邐逡逑３．結邋果逡逑３．１邋．細胞系形態(tài)的比較逡逑下圖各細胞培養(yǎng)時光鏡圖片，我們由圖可見在人正常膀胱上皮細胞系逡逑ＳＶ－ＨＵＣ－１及４種膀胱癌細胞系均可見各細胞均呈多邊形生長，這提示了細胞已逡逑經進行了分化，且形態(tài)上無明顯差異。逡逑

為進？步顯示各個細胞系對ＧＳＫ刺激的差異，選S謂詠０螂咨掀は赴義舷檔模�？有效浓洱x牛茫擔板澹ǎ常埃睿停┳魑冉希抵窒赴擋鉅斕謀曜�。在３０ｎFǘ鵲膩義希牽櫻舜碳五種細胞系鈣離Ｔ變化劑貴效應關系如圖５Ａ，，細胞內鈣離子內流最逡逑大升高幅度在正常膀胱上皮細胞系ＳＶ－ＨＵＣ－１、膀胱癌細胞系５６３７、Ｔ２４中別為逡逑１．０７±０．０７，０．３７±０．０４邋及邋０．６０＊０．１２，而邋ＧＳＫ邋１０１６７９０Ａ邋在邋Ｊ８２邋及邋ＳＷ１７１０邋膀胱癌逡逑細胞系未引起胞內鈣離子濃度的變化，正常細胞系與其它四種癌細胞系相比有明逡逑顯差異，經方差分析檢驗，Ｐ＜０．０１，，具有統(tǒng)計學意義。正常細胞系與其他各細逡逑胞系兩兩比較均顯示差異（Ｐ均小于０．０１）。細胞發(fā)生鈣內流反應的細胞百分比逡逑在人正常上皮細胞系ＳＶ－ＨＵＣ－丨、膀胱癌細胞系５６３７、Ｔ２４、ＳＷ１７１０及Ｊ８２細逡逑胞中分別為５２．２０％，邋１％，邋２５％，邋０及０，與細胞內鈣離子變化幅度結果一致，經逡逑卡方檢驗，ＰＣ０．０１，具有統(tǒng)計學意義（表２）。各細胞系間幅度的比較可見正常逡逑膀胱上皮細胞系升高幅度較大（圖５Ｂ）。各細胞系百分比的比較與鈣內流升高逡逑幅度結果相同（圖５Ｃ）。因此我們的實驗表明ＴＲＰＶ４通道受體在激動劑３０ｎＭ逡逑ＧＳＫ的刺激T，正常膀胱上皮細胞系較膀胱癌細胞系發(fā)生鈣內流細胞數(shù)量更多，逡逑鈣內流幅度更大，且Ｐ＜０．０１，具有統(tǒng)計學意義。逡逑２３逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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本文編號：2707884