發(fā)布時間：2020-06-10 11:09

【摘要】：研究背景和目的前列腺癌是男性最常見的腫瘤之一,在西方國家的發(fā)病率普遍較高。我國男性發(fā)病率雖然低于西方國家,但近年來呈逐年上升趨勢,前列腺癌晚期患者數(shù)較多,死亡率較高。目前雄激素剝奪治療法是前列腺癌的主要治療方法,許多前列腺癌患者在接受雄激素剝奪治療后,不可避免的由雄激素依賴性前列腺癌發(fā)展成雄激素不依賴性前列腺癌,前列腺癌細胞的增殖能力增強,對化療和放療的抵抗能力增強,這為腫瘤的治療帶來困難。腫瘤干細胞是一類具有自我更新能力和分化潛能的惡性腫瘤細胞,它維持腫瘤細胞增殖,并分化出具有不同功能的腫瘤細胞。研究表明在前列腺癌組織中存在前列腺癌干細胞,但是前列腺癌干細胞的來源及其標記分子仍不清楚。CD133最早在造血干細胞和神經(jīng)干細胞中發(fā)現(xiàn),是造血和神經(jīng)干細胞的重要標記分子。在多種腫瘤中,例如黑色素瘤、神經(jīng)膠質瘤等將CD133作為腫瘤干細胞標記分子。有文獻報道在前列腺癌細胞中,CD133~+前列腺癌細胞表現(xiàn)出較強的克隆形成能力、抵抗藥物的能力和抵抗射線的能力,但CD133是否可以作為前列腺癌干細胞的標記分子仍存在很大爭議。LMO4屬于LMO家族成員,是重要的核轉錄因子。LMO4在在胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,包括神經(jīng),皮膚,耳蝸的發(fā)育。有研究表明lmo4-/-小鼠在圍產(chǎn)期致死率較高,并且神經(jīng)管閉合不全。在成人的不同組織中LMO4的表達量也有差異,在胃、小腸、腎組織中表達量較高,而前列腺、精囊等組織中表達量較低。許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與LMO4的異常表達有關,在乳腺癌細胞系中過量表達LMO4,細胞的遷移和侵襲能力增強。對乳腺癌患者的病理組織研究發(fā)現(xiàn),LMO4在乳腺癌組織中的mRNA和蛋白水平均提高,并且LMO4表達量較高的患者預后較差。在造血細胞增殖與分化的研究過程中發(fā)現(xiàn)LIM結構域結合蛋白LDB-1和LMO家族蛋白LMO2、LMO4、周期蛋白依賴性激酶CDK9等共同組成一個大復合體調控細胞的細胞增殖過程。當細胞被誘導分化、增殖停止時,ETO-2等蛋白新的復合體從大復合體中脫落,大復合體變?yōu)閮蓚�小復合體,CDK9從LDB1上脫落,LMO4蛋白水平上升結合在LDB-1等蛋白構成的核心復合體中,在終末分化之后開始基因的轉錄。LMO4的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關,但與前列腺癌之間的研究較少,LMO4是否參與調控前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程仍不清楚;與CD133~-前列腺細癌細胞相比,前列腺癌CD133~+細胞對放化療有很強的抵抗能力,較強的增殖能力。LMO4是否影響CD133的表達和前列腺癌CD133陽性細胞數(shù),是否影響前列腺癌細胞的增殖能力有待探究。本研究可能為前列腺癌的治療方法提供新思路。研究方法在組織學水平研究中,利用前列腺癌組織和正常前列腺組織的切片,HE染色觀察前列腺癌組織結構特征;免疫組織化學法檢測LMO4與CD133的表達,探究LMO4和CD133在前列腺癌組織中的表達水平以及是否具有表達一致性。在細胞水平的研究用人前列腺癌細胞系PC-3作為研究對象,利用流式分選技術從PC-3細胞中分選出CD133~+細胞PC-3/CD133~+和CD133~-細胞PC-3/CD133~-,軟瓊脂克隆形成實驗檢測PC-3/CD133~+的克隆形成能力,qPCR檢測干細胞標記分子CD44、OCT-4和SOX2的mRNA水平。在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4獲得PC-3/SiLmo4細胞株,Western blot檢測LMO4和CD133的蛋白表達水平,免疫熒光實驗和流式細胞術檢測前列腺癌CD133~+細胞數(shù)的變化。通過EDU細胞增殖實驗檢測人前列腺癌細胞的增殖速率。免疫共沉淀法檢測LMO4與CDK9在前列腺癌細胞中的相互作用和動態(tài)變化。研究結果(1)HE染色證實了前列腺癌組織標本符合前列腺癌組織特征,表現(xiàn)為前列腺癌組織內腺體形狀大小改變,失去腺體結構。癌細胞浸潤周圍基質,腺體相互融合,可見不規(guī)則浸潤性腫塊或惡性上皮細胞構成的索和鏈(2)免疫組織化學染色表明,與前列腺增生組織相比,在前列腺癌組織中LMO4和CD133的表達水平較高。1在前列腺癌組織中腺體結構消失,惡性上皮細胞細胞膜表面可見CD133高表達。在10例前列腺癌組織切片中有8例CD133的表達量增高,而7例前列腺增生組織中腺體結構完整,CD133的表達均為陰性。(2)前列腺癌組織部位LMO4的表達顯著增高。惡性上皮細胞細胞核內可見LMO4表達上升;在前列腺增生組織中,LMO4的表達量整體較低,部分上皮細胞核內可見LMO4表達。在10例前列腺癌組織切片中有8例LMO4表達量升高,而7例前列腺增生組織中僅有2例LMO4表達量升高,在7例前列腺癌組織切片中LMO4與CD133均成陽性,LMO4與前列腺癌干性標記分子CD133的表達具有一致性。(2)Western blot結果顯示,在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的表達量降低,LMO4與CD133的表達具有一致性。干涉Lmo4后使前列腺癌細胞的CD133表達水平降低。(3)免疫熒光實驗顯示,在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的熒光強度降低,CD133~+細胞數(shù)減少。(4)流式細胞術結果表明,在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,利用帶熒光標記的Alexa Fluor 647~(TM)標記CD133分子,流式細胞分析技術顯示CD133陽性細胞數(shù)減少,提示LMO4影響前列腺癌CD133~+細胞數(shù)量。(5)在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,前列腺癌細胞PC-3的增殖能力降低。通過EDU細胞摻入實驗顯示,在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,EDU的摻入量減少,經(jīng)熒光標記后顯示陽性細胞減少。提示LMO4與前列腺癌細胞的增殖有關,在人前列腺癌細胞系PC-3中降低LMO4的表達,細胞的增殖減慢。(6)克隆形成實驗表明,在人前列腺癌細胞系PC-3中CD133~-細胞克隆形成數(shù)低于CD133~+細胞克隆形成數(shù)。利用流式分選技術分選出CD133~+和CD133~-細胞,將相同數(shù)目的細胞接種于軟瓊脂培養(yǎng)基中,CD133~+細胞的克隆形成率為12.5%顯著高于CD133~-細胞的克隆形成率5.75%。與PC-3/CD133~-細胞相比PC-3/CD133~+細胞具有更強的克隆形成能力。在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后,克隆形成率由24.00%降至7.10%。在人前列腺癌細胞系PC-3中干涉Lmo4后克隆形成能能力降低。(7)免疫共沉淀方法證實正常前列腺細胞中LMO4與CDK9形成復合體,過量表達LMO4后使二者結合減少;而在前列腺癌細胞中未見LMO4/CDK9復合體的形成。研究結論(1)在前列腺癌組織和細胞中LMO4與CD133的表達具有一致性,LMO4可能調控CD133的表達水平和CD133~+細胞數(shù)。(2)LMO4調控前列腺癌細胞的增殖有關。(3)前列腺癌細胞中LMO4調控細胞的增殖不依賴于LMO4/CDK9的復合體。
【圖文】：

2.1.3 實驗用生物材料（1）組織標本本實驗所使用的前列腺癌和前列腺增生組織切片由安徽醫(yī)科大學第一附院病理科提供。（2）細胞系人前列腺癌細胞系PC-3和人正常前列腺細胞系PET2-TGC。人前列腺癌細由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院張力博士惠贈，人前列腺細胞系由上海中醫(yī)藥柯細松教授惠贈。（3）載體干涉 LMO4 所使用的慢病毒載體 GV248，，過表達 LMO4 所使用的慢病毒GV287，人慢病毒干涉質粒 shRNAb-Lmo4 和 shRNAc-Lmo4 均購自上海吉凱公司（Figure 2），人過表達 LMO4 慢病毒購自上海吉凱基因公司。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文3. 實驗結果3.1 組織學水平研究證實核轉錄因子LMO4在前列腺組織中高表達3.1.1 蘇木精-伊紅染色觀察前列腺癌組織結構變化對前列腺癌組織和前列腺增生組織進行H&E染色。結果顯示與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織內腺體與腺體距離減小，腺體的形狀大小改變，失去腺體結構。癌細胞浸潤周圍基質，腺體相互融合，可見不規(guī)則浸潤性腫塊或惡性上皮細胞構成的索和鏈（Figure 1）。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.25

【相似文獻】

相關期刊論文 前9條

1 張露,華芳,孫志軍,張旗,樊明文,陳智;轉錄調節(jié)因子LMO4在牙胚發(fā)育中的基因表達[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2005年05期

2 趙宇;趙敏;;LMO4在阿爾茨海默氏病轉基因小鼠海馬的表達[J];解剖科學進展;2013年03期

3 陳曉軍;劉勝春;;早期胃癌中淋巴結微轉移及LMO4、DLEC1表達的臨床意義[J];實用癌癥雜志;2014年11期

4 王雯s

本文編號：2706208