【摘要】：研究背景和目的前列腺癌是男性最常見(jiàn)的腫瘤之一,在西方國(guó)家的發(fā)病率普遍較高。我國(guó)男性發(fā)病率雖然低于西方國(guó)家,但近年來(lái)呈逐年上升趨勢(shì),前列腺癌晚期患者數(shù)較多,死亡率較高。目前雄激素剝奪治療法是前列腺癌的主要治療方法,許多前列腺癌患者在接受雄激素剝奪治療后,不可避免的由雄激素依賴性前列腺癌發(fā)展成雄激素不依賴性前列腺癌,前列腺癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),對(duì)化療和放療的抵抗能力增強(qiáng),這為腫瘤的治療帶來(lái)困難。腫瘤干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新能力和分化潛能的惡性腫瘤細(xì)胞,它維持腫瘤細(xì)胞增殖,并分化出具有不同功能的腫瘤細(xì)胞。研究表明在前列腺癌組織中存在前列腺癌干細(xì)胞,但是前列腺癌干細(xì)胞的來(lái)源及其標(biāo)記分子仍不清楚。CD133最早在造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),是造血和神經(jīng)干細(xì)胞的重要標(biāo)記分子。在多種腫瘤中,例如黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等將CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記分子。有文獻(xiàn)報(bào)道在前列腺癌細(xì)胞中,CD133~+前列腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的克隆形成能力、抵抗藥物的能力和抵抗射線的能力,但CD133是否可以作為前列腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記分子仍存在很大爭(zhēng)議。LMO4屬于LMO家族成員,是重要的核轉(zhuǎn)錄因子。LMO4在在胚胎的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,包括神經(jīng),皮膚,耳蝸的發(fā)育。有研究表明lmo4-/-小鼠在圍產(chǎn)期致死率較高,并且神經(jīng)管閉合不全。在成人的不同組織中LMO4的表達(dá)量也有差異,在胃、小腸、腎組織中表達(dá)量較高,而前列腺、精囊等組織中表達(dá)量較低。許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與LMO4的異常表達(dá)有關(guān),在乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)LMO4,細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。對(duì)乳腺癌患者的病理組織研究發(fā)現(xiàn),LMO4在乳腺癌組織中的mRNA和蛋白水平均提高,并且LMO4表達(dá)量較高的患者預(yù)后較差。在造血細(xì)胞增殖與分化的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白LDB-1和LMO家族蛋白LMO2、LMO4、周期蛋白依賴性激酶CDK9等共同組成一個(gè)大復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞的細(xì)胞增殖過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)分化、增殖停止時(shí),ETO-2等蛋白新的復(fù)合體從大復(fù)合體中脫落,大復(fù)合體變?yōu)閮蓚�(gè)小復(fù)合體,CDK9從LDB1上脫落,LMO4蛋白水平上升結(jié)合在LDB-1等蛋白構(gòu)成的核心復(fù)合體中,在終末分化之后開(kāi)始基因的轉(zhuǎn)錄。LMO4的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但與前列腺癌之間的研究較少,LMO4是否參與調(diào)控前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程仍不清楚;與CD133~-前列腺細(xì)癌細(xì)胞相比,前列腺癌CD133~+細(xì)胞對(duì)放化療有很強(qiáng)的抵抗能力,較強(qiáng)的增殖能力。LMO4是否影響CD133的表達(dá)和前列腺癌CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),是否影響前列腺癌細(xì)胞的增殖能力有待探究。本研究可能為前列腺癌的治療方法提供新思路。研究方法在組織學(xué)水平研究中,利用前列腺癌組織和正常前列腺組織的切片,HE染色觀察前列腺癌組織結(jié)構(gòu)特征;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LMO4與CD133的表達(dá),探究LMO4和CD133在前列腺癌組織中的表達(dá)水平以及是否具有表達(dá)一致性。在細(xì)胞水平的研究用人前列腺癌細(xì)胞系PC-3作為研究對(duì)象,利用流式分選技術(shù)從PC-3細(xì)胞中分選出CD133~+細(xì)胞PC-3/CD133~+和CD133~-細(xì)胞PC-3/CD133~-,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC-3/CD133~+的克隆形成能力,qPCR檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記分子CD44、OCT-4和SOX2的mRNA水平。在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4獲得PC-3/SiLmo4細(xì)胞株,Western blot檢測(cè)LMO4和CD133的蛋白表達(dá)水平,免疫熒光實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前列腺癌CD133~+細(xì)胞數(shù)的變化。通過(guò)EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞的增殖速率。免疫共沉淀法檢測(cè)LMO4與CDK9在前列腺癌細(xì)胞中的相互作用和動(dòng)態(tài)變化。研究結(jié)果(1)HE染色證實(shí)了前列腺癌組織標(biāo)本符合前列腺癌組織特征,表現(xiàn)為前列腺癌組織內(nèi)腺體形狀大小改變,失去腺體結(jié)構(gòu)。癌細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)|(zhì),腺體相互融合,可見(jiàn)不規(guī)則浸潤(rùn)性腫塊或惡性上皮細(xì)胞構(gòu)成的索和鏈(2)免疫組織化學(xué)染色表明,與前列腺增生組織相比,在前列腺癌組織中LMO4和CD133的表達(dá)水平較高。1在前列腺癌組織中腺體結(jié)構(gòu)消失,惡性上皮細(xì)胞細(xì)胞膜表面可見(jiàn)CD133高表達(dá)。在10例前列腺癌組織切片中有8例CD133的表達(dá)量增高,而7例前列腺增生組織中腺體結(jié)構(gòu)完整,CD133的表達(dá)均為陰性。(2)前列腺癌組織部位LMO4的表達(dá)顯著增高。惡性上皮細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)LMO4表達(dá)上升;在前列腺增生組織中,LMO4的表達(dá)量整體較低,部分上皮細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)LMO4表達(dá)。在10例前列腺癌組織切片中有8例LMO4表達(dá)量升高,而7例前列腺增生組織中僅有2例LMO4表達(dá)量升高,在7例前列腺癌組織切片中LMO4與CD133均成陽(yáng)性,LMO4與前列腺癌干性標(biāo)記分子CD133的表達(dá)具有一致性。(2)Western blot結(jié)果顯示,在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的表達(dá)量降低,LMO4與CD133的表達(dá)具有一致性。干涉Lmo4后使前列腺癌細(xì)胞的CD133表達(dá)水平降低。(3)免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,CD133的熒光強(qiáng)度降低,CD133~+細(xì)胞數(shù)減少。(4)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,利用帶熒光標(biāo)記的Alexa Fluor 647~(TM)標(biāo)記CD133分子,流式細(xì)胞分析技術(shù)顯示CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,提示LMO4影響前列腺癌CD133~+細(xì)胞數(shù)量。(5)在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖能力降低。通過(guò)EDU細(xì)胞摻入實(shí)驗(yàn)顯示,在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,EDU的摻入量減少,經(jīng)熒光標(biāo)記后顯示陽(yáng)性細(xì)胞減少。提示LMO4與前列腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān),在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中降低LMO4的表達(dá),細(xì)胞的增殖減慢。(6)克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中CD133~-細(xì)胞克隆形成數(shù)低于CD133~+細(xì)胞克隆形成數(shù)。利用流式分選技術(shù)分選出CD133~+和CD133~-細(xì)胞,將相同數(shù)目的細(xì)胞接種于軟瓊脂培養(yǎng)基中,CD133~+細(xì)胞的克隆形成率為12.5%顯著高于CD133~-細(xì)胞的克隆形成率5.75%。與PC-3/CD133~-細(xì)胞相比PC-3/CD133~+細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力。在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后,克隆形成率由24.00%降至7.10%。在人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中干涉Lmo4后克隆形成能能力降低。(7)免疫共沉淀方法證實(shí)正常前列腺細(xì)胞中LMO4與CDK9形成復(fù)合體,過(guò)量表達(dá)LMO4后使二者結(jié)合減少;而在前列腺癌細(xì)胞中未見(jiàn)LMO4/CDK9復(fù)合體的形成。研究結(jié)論(1)在前列腺癌組織和細(xì)胞中LMO4與CD133的表達(dá)具有一致性,LMO4可能調(diào)控CD133的表達(dá)水平和CD133~+細(xì)胞數(shù)。(2)LMO4調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。(3)前列腺癌細(xì)胞中LMO4調(diào)控細(xì)胞的增殖不依賴于LMO4/CDK9的復(fù)合體。
【圖文】：

2.1.3 實(shí)驗(yàn)用生物材料（1）組織標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)所使用的前列腺癌和前列腺增生組織切片由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附院病理科提供。（2）細(xì)胞系人前列腺癌細(xì)胞系PC-3和人正常前列腺細(xì)胞系PET2-TGC。人前列腺癌細(xì)由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院張力博士惠贈(zèng)，人前列腺細(xì)胞系由上海中醫(yī)藥柯細(xì)松教授惠贈(zèng)。（3）載體干涉 LMO4 所使用的慢病毒載體 GV248，，過(guò)表達(dá) LMO4 所使用的慢病毒GV287，人慢病毒干涉質(zhì)粒 shRNAb-Lmo4 和 shRNAc-Lmo4 均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司（Figure 2），人過(guò)表達(dá) LMO4 慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 組織學(xué)水平研究證實(shí)核轉(zhuǎn)錄因子LMO4在前列腺組織中高表達(dá)3.1.1 蘇木精-伊紅染色觀察前列腺癌組織結(jié)構(gòu)變化對(duì)前列腺癌組織和前列腺增生組織進(jìn)行H&E染色。結(jié)果顯示與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織內(nèi)腺體與腺體距離減小，腺體的形狀大小改變，失去腺體結(jié)構(gòu)。癌細(xì)胞浸潤(rùn)周?chē)|(zhì)，腺體相互融合，可見(jiàn)不規(guī)則浸潤(rùn)性腫塊或惡性上皮細(xì)胞構(gòu)成的索和鏈（Figure 1）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：2706208