【摘要】：目的:前列腺癌在男性惡性腫瘤的發(fā)生率排名第二位,隨著我國現(xiàn)代化進(jìn)程的加速和人口老齡化的加劇,前列腺癌已經(jīng)成為威脅我國男性健康的主要疾病之一。RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif 3,RBM3)是冷應(yīng)激蛋白家族成員之一,近些年的研究發(fā)現(xiàn)RBM3的特異表達(dá)與包括卵巢癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、膀胱癌、結(jié)直腸癌以及前列腺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生相關(guān),因此認(rèn)為其是一種潛在的癌相關(guān)基因,在促進(jìn)細(xì)胞增殖和減弱細(xì)胞凋亡的過程中有重要作用,特別是與前列腺癌的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。但是RBM3究竟在前列腺癌的發(fā)展中起到什么樣的作用還存在著較大的爭議。在本項(xiàng)研究中,我們試圖用二代測序的技術(shù)手段在基因水平上對以上問題進(jìn)行初步的探索。方法:1.構(gòu)建RBM3敲減的前列腺癌細(xì)胞系,提取RNA并建立cDNA文庫。2.利用高通量測序技術(shù)對細(xì)胞樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,經(jīng)過對原始測序數(shù)據(jù)的過濾和質(zhì)量評估,篩選出基于RBM3基因變化引起的差異表達(dá)基因。3.通過GO基因注釋、pathway信號通路分析及信號通路互作分析、差異基因互作網(wǎng)絡(luò)分析揭示RBM3與前列腺癌的關(guān)系。4.通過RT-qPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證分析,最終確定RBM3調(diào)節(jié)前列腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵差異基因。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBM3敲減的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3-siRBM3中有698個(gè)差異表達(dá)基因,其中446個(gè)基因上調(diào),252個(gè)基因下調(diào)。2.基因功能注釋及通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在脂質(zhì)代謝、突觸傳遞、G蛋白偶聯(lián)受體、細(xì)胞膜去極化等條目中。3.通過pathway信號通路分析及信號通路互作分析發(fā)現(xiàn),和脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路,如乙醚脂類代謝,亞油酸代謝,α亞油酸代謝是諸多信號通路的核心;和神經(jīng)疾病或神經(jīng)退化相關(guān)的通路,如谷氨酸能突觸傳遞和伽馬氨基丁酸突觸傳遞也在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)了顯著的位置。4.通過差異基因互作網(wǎng)絡(luò)及GO基因注釋和pathway信號通路分析,我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)通路中的差異基因與前列腺癌密切相關(guān)。磷脂酶A2家族中的基因被多次富集,如PLA2G2A、PLA2G2F、PLA2G4C、PLA2G3在兩組細(xì)胞系中的表達(dá)水平差異最為明顯(p值分別為PLA2G2A:0.0024,PLA2G2F:1.42×10~(-5),PLA2G4C:0.046,PLA2G3:0.018)。5.差異基因互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示GNG5、EDN1、NOS3、GAL、ACE、CD38等擁有較高的基因節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù),彼此間的作用關(guān)系密切,且和其他差異基因的作用廣泛,在網(wǎng)絡(luò)中屬于核心基因。6.此外,GNG5和G蛋白偶聯(lián)受體信號通路,EDN1和血管生成相關(guān)通路,CD38和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,NOS3與一氧化氮合成途徑,CYP2B6與藥物代謝的關(guān)系,GAL與其受體的活化狀態(tài),ACE基因的多態(tài)性也與RBM3的調(diào)控密切相關(guān)。7.通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示多數(shù)差異基因的變化和測序結(jié)果相符,測序結(jié)果的可信度較高。結(jié)論:我們通過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)手段分析RBM3敲減對前列腺癌細(xì)胞株中基因的變化,并通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對測序結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。通過差異基因的篩選、生物信息學(xué)分析確定了與前列腺癌關(guān)系密切的基因,如PLA2G2A、PLA2G2F、PLA2G4C、PLA2G3等。而且發(fā)現(xiàn)了脂質(zhì)代謝相關(guān)的通路是RBM3敲減后前列腺癌細(xì)胞中PC3-siRBM3顯著變化的核心信號通路。這些發(fā)現(xiàn)提示我們RBM3可能是通過脂質(zhì)代謝通路來調(diào)節(jié)前列腺癌進(jìn)展的。RBM3還可能在神經(jīng)疾病或神經(jīng)退化的調(diào)節(jié)中與谷氨酸能突觸和伽馬氨基丁酸突觸傳遞有著密切的關(guān)系。通過這些基因和通路可以對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展作進(jìn)一步的深入研究,為我們今后對RBM3的調(diào)節(jié)作用的研究提供了嶄新的視角。
【圖文】：

圖 3.1 RBM3 在各株細(xì)胞中的表達(dá)情況A：RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)中 RBM3 在各株細(xì)胞系中的表達(dá)情況，* p<0.05。 B：Western Blot 實(shí)驗(yàn)中RBM3 在各株細(xì)胞系中的表達(dá)。其中 PC3-R1 細(xì)胞系中，因?yàn)榻Y(jié)合了 GFP 熒光物質(zhì)，使得 RBM3的表達(dá)量不是內(nèi)源性表達(dá)量 17kDa，而是約 42kDa （GFP 分子量 25kDa）。圖中 PC3-siR1、PC3-siR2、PC3-siR3 三株細(xì)胞系的 RBM3 表達(dá)水平均較 PC3 下降且和 RT-qPCR 結(jié)果相符。3.2 總 RNA 質(zhì)檢及測序參數(shù)RNA 的質(zhì)檢列表見表 3.1，全部樣品的 OD260/280 比值均在 1.8-2.1 之間，符合測序的基本要求；用于測序的兩個(gè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖顯示 RNA 的完整性較好，，可以用作后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn)，見圖 3.2。表 3.1 RNA 質(zhì)量檢測列表序號 樣品 濃度（ng/μl） OD 260/280 OD260/230

si1(2) 564.7 si1(3) 571.4 si2(1) 550.3 si2(2) 564.7 si2(3) 488.9 si3(1) 560.2 si3(2) 539.3 si3(3) 471.1 siNC(1) 608.4 siNC(2) 587.5 siNC(3) 528.0
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Binhua P.Zhou;;Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer progression and metastasis[J];癌癥;2011年09期

本文編號：2705523