發(fā)布時間：2020-06-09 22:53

【摘要】：腎小球疾病(glomerular diseases,GD)是一組累及雙側腎小球的腎臟疾病,是我國慢性腎衰竭的常見病因。盡管不同腎小球疾病的病因、病理分型、臨床分類及預后各不相同,大量蛋白尿的出現(xiàn)是腎小球疾病患者重要的臨床表現(xiàn)。在慢性腎臟疾病中,蛋白尿不僅是腎小球疾病的重要表現(xiàn)形式,更是腎臟疾病進行性加重、惡化的因素之一。足細胞(podocyte)是維持腎小球內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要組成部分,與腎小球內(nèi)皮細胞和基底膜共同組成了腎小球濾過屏障,足細胞損傷可引起腎小球濾過屏障的破壞,產(chǎn)生蛋白尿,最終加重腎臟損傷。因此,尋找參與腎小球疾病足細胞損傷相關的關鍵分子,通過改善足細胞損傷而減輕蛋白尿,是當前腎臟疾病治療的重要手段之一,也是對療效進行判斷的重要指標。甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DGKs)是體內(nèi)肌醇磷脂信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子,生理情況下通過磷酸化甘油二酯(diacylglycerol,DAG)為磷脂酸(phosphatidicacid,PA)來調(diào)節(jié)細胞的功能活動。由于其底物(甘油二酯)和產(chǎn)物(磷脂酸)均為生物體內(nèi)重要的信號分子,因此DGKs具有重要的生物學功能。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 10個DGK家族成員,分屬于5個亞類。除了共有催化結構域和Cl結構域外,他們的分子結構以及分布不同,生物學功能亦有所不同。甘油二酯激酶E(DGKE,DGKEε,DGK5)是III亞類中唯一的成員,與其它成員相比,其結構最簡單,且具有花生四烯酸甘油二酯(AA-DAG)的底物特異性,這些特點提示我們DGKE可能在生理和病理條件下發(fā)揮與其他家族成員不同的作用。新近的臨床研究表明,在非典型性溶血性尿毒綜合征(atypical hemolytic urermic syndrome,aHUS)和腎小球微血管病變等蛋白尿相關腎臟疾病中出現(xiàn)了 DGKE功能缺失性的基因突變,說明DGKE已成為研究腎臟疾病的重要靶標。但是目前關于DGKE在腎臟疾病中的研究多集中在臨床基因多態(tài)性檢測方面,缺乏系統(tǒng)的實驗性研究。研究目的本課題將通過使用足細胞條件性基因過表達動物和體外培養(yǎng)的足細胞,建立嘌呤霉素氨基核苷和阿霉素腎病兩種腎小球疾病足細胞損傷模型,研究DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的作用,并初步探討其發(fā)揮作用的分子生物學機制。1.探究DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的表達變化。2.明確DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的作用。3.探討DGKE在腎小球疾病足細胞損傷的作用機制。研究方法與結果1.DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的表達變化選取8-12周齡雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠,實驗室條件下適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為正常對照組和模型組。動物麻醉后尾靜脈注射劑量360mg/kg 的嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)和 15mg/kg的阿霉素(adriamycin,ADR)分別構建兩種腎小球疾病足細胞損傷模型。應用Real-time PCR、蛋白免疫印跡法(western blot,WB)、免疫組化(immunohistochemistry,IHC)和免疫熒光(immunofluorescence,IF)等方法,檢測DGKE在腎皮質(zhì)中的表達變化。結果顯示與對照組相比,DGKE在兩種腎小球疾病足細胞損傷模型腎皮質(zhì)中表達明顯降低。體外培養(yǎng)人源足細胞(human podocyte,HPC),分別使用PAN和ADR進行處理,結果顯示,與正常對照組相比,PAN和ADR處理下足細胞中的DGKE表達顯著降低。2.DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的作用構建DGKEflox/flox小鼠,與Podocin-Cre小鼠雜交,通過Cre-Lop技術獲得特異性腎臟足細胞DGKE基因過表達小鼠(Podocin-Cre/DGKEflox/flox),以適齡的基因型為Podo-Cre-/DGKEflox/flox的小鼠作為對照,分別構建兩種腎小球疾病足細胞損傷模型。通過PAS染色和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察小鼠腎小球形態(tài)和足細胞的超微結構。結果顯示,與對照組相比,足細胞特異性過表達DGKE組腎小球疾病模型動物腎小球系膜基質(zhì)增生和腎小球硬化現(xiàn)象明顯減少,且足細胞中足突的融合、脫落程度亦顯著減輕。使用免疫熒光法標記足細胞結構蛋白Nephrin和Podocin,結果顯示,與對照組相比,足細胞特異性過表達DGKE可部分糾正腎小球疾病模型動物足細胞中結構蛋白Nephrin和Podocin的降低。體外培養(yǎng)人足細胞,轉(zhuǎn)染攜帶DGKE全長基因序列的腺病毒,結果顯示,足細胞過表達DGKE可以顯著降低PAN和ADR等腎毒性藥物引起的細胞損傷以及結構蛋白的缺失。這些結果表明DGKE對腎小球疾病足細胞損傷具有保護作用。3.DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中的作用機制初探我們通過實時定量PCR和Western blot的方法發(fā)現(xiàn)腎小球疾病模型動物腎皮質(zhì)中TRPC6的mRNA和蛋白水平顯著高于對照組,而足細胞特異性過表達DGKE后可降低TRPC6的表達,且DGKE足細胞特異性過表達也可以降低由損傷引起的細胞內(nèi)鈣離子超載。說明DGKE對腎小球疾病足細胞損傷的保護作用可能與下調(diào)TRPC6的表達有關,但本研究中細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化是否確實由DGKE對TRPC6的調(diào)控作用實現(xiàn)的尚需進一步研究證實�？紤]到DGKE的激酶活性,我們也對足細胞特異性過表達DGKE動物的腎皮質(zhì)進行了蛋白磷酸化質(zhì)譜分析。結果顯示,腎小球足細胞特異性過表達DGKE動物腎小球中卷曲螺旋蛋白37(coiled-coil domain containing 37,CCDC37)出現(xiàn)了絲氨酸磷酸化。進一步使用免疫共沉淀技術(Co-IP),我們發(fā)現(xiàn)DGKE與CCDC37之間確實存在相互作用。由于目前CCDC37蛋白的生物學功能尚不明確,DGKE對腎小球疾病足細胞損傷的保護作用是否與其對CCDC37的磷酸化調(diào)控有關有待于進一步研究。結論及創(chuàng)新性本課題首次通過條件性過表達模式動物結合體外轉(zhuǎn)染技術,明確DGKE在腎小球疾病足細胞損傷中發(fā)揮保護作用,并初步探討其作用機制。本研究將為腎小球疾病及其他足細胞損傷性腎臟疾病的病因研究和干預策略提供新的思路,具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。
【圖文】：

山東大學碩士學位論文實驗結果逡逑第一部分ＤＧＫＥ在腎小球疾病足細胞損傷中的表達逡逑１．嘌呤霉素氨基核苷腎病小鼠腎皮質(zhì)的表征逡逑尿液離心后使用自動生化分析儀測定白蛋白和尿肌酐，，以尿白蛋白（ＵＡＣＲ）比值（圖ｌａ）判定腎小球疾病模型是否成功。結果顯示與正常比，ＰＡＮ處理組小鼠的尿白蛋白肌酐比值明顯升高。進一步通過ＰＡＳ邋（圖透射電鏡（圖ｌｃ）檢測發(fā)現(xiàn)腎小球出現(xiàn)系膜X椛�，壹s白閬赴閫蝗諍系認窒蟆ｅ義

本文編號：2705374