【摘要】：腎小球疾病(glomerular diseases,GD)是一組累及雙側(cè)腎小球的腎臟疾病,是我國(guó)慢性腎衰竭的常見病因。盡管不同腎小球疾病的病因、病理分型、臨床分類及預(yù)后各不相同,大量蛋白尿的出現(xiàn)是腎小球疾病患者重要的臨床表現(xiàn)。在慢性腎臟疾病中,蛋白尿不僅是腎小球疾病的重要表現(xiàn)形式,更是腎臟疾病進(jìn)行性加重、惡化的因素之一。足細(xì)胞(podocyte)是維持腎小球內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要組成部分,與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜共同組成了腎小球?yàn)V過(guò)屏障,足細(xì)胞損傷可引起腎小球?yàn)V過(guò)屏障的破壞,產(chǎn)生蛋白尿,最終加重腎臟損傷。因此,尋找參與腎小球疾病足細(xì)胞損傷相關(guān)的關(guān)鍵分子,通過(guò)改善足細(xì)胞損傷而減輕蛋白尿,是當(dāng)前腎臟疾病治療的重要手段之一,也是對(duì)療效進(jìn)行判斷的重要指標(biāo)。甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DGKs)是體內(nèi)肌醇磷脂信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子,生理情況下通過(guò)磷酸化甘油二酯(diacylglycerol,DAG)為磷脂酸(phosphatidicacid,PA)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能活動(dòng)。由于其底物(甘油二酯)和產(chǎn)物(磷脂酸)均為生物體內(nèi)重要的信號(hào)分子,因此DGKs具有重要的生物學(xué)功能。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 10個(gè)DGK家族成員,分屬于5個(gè)亞類。除了共有催化結(jié)構(gòu)域和Cl結(jié)構(gòu)域外,他們的分子結(jié)構(gòu)以及分布不同,生物學(xué)功能亦有所不同。甘油二酯激酶E(DGKE,DGKEε,DGK5)是III亞類中唯一的成員,與其它成員相比,其結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單,且具有花生四烯酸甘油二酯(AA-DAG)的底物特異性,這些特點(diǎn)提示我們DGKE可能在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮與其他家族成員不同的作用。新近的臨床研究表明,在非典型性溶血性尿毒綜合征(atypical hemolytic urermic syndrome,aHUS)和腎小球微血管病變等蛋白尿相關(guān)腎臟疾病中出現(xiàn)了 DGKE功能缺失性的基因突變,說(shuō)明DGKE已成為研究腎臟疾病的重要靶標(biāo)。但是目前關(guān)于DGKE在腎臟疾病中的研究多集中在臨床基因多態(tài)性檢測(cè)方面,缺乏系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)性研究。研究目的本課題將通過(guò)使用足細(xì)胞條件性基因過(guò)表達(dá)動(dòng)物和體外培養(yǎng)的足細(xì)胞,建立嘌呤霉素氨基核苷和阿霉素腎病兩種腎小球疾病足細(xì)胞損傷模型,研究DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的作用,并初步探討其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制。1.探究DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化。2.明確DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的作用。3.探討DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。研究方法與結(jié)果1.DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的表達(dá)變化選取8-12周齡雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠,實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組。動(dòng)物麻醉后尾靜脈注射劑量360mg/kg 的嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)和 15mg/kg的阿霉素(adriamycin,ADR)分別構(gòu)建兩種腎小球疾病足細(xì)胞損傷模型。應(yīng)用Real-time PCR、蛋白免疫印跡法(western blot,WB)、免疫組化(immunohistochemistry,IHC)和免疫熒光(immunofluorescence,IF)等方法,檢測(cè)DGKE在腎皮質(zhì)中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,DGKE在兩種腎小球疾病足細(xì)胞損傷模型腎皮質(zhì)中表達(dá)明顯降低。體外培養(yǎng)人源足細(xì)胞(human podocyte,HPC),分別使用PAN和ADR進(jìn)行處理,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,PAN和ADR處理下足細(xì)胞中的DGKE表達(dá)顯著降低。2.DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的作用構(gòu)建DGKEflox/flox小鼠,與Podocin-Cre小鼠雜交,通過(guò)Cre-Lop技術(shù)獲得特異性腎臟足細(xì)胞DGKE基因過(guò)表達(dá)小鼠(Podocin-Cre/DGKEflox/flox),以適齡的基因型為Podo-Cre-/DGKEflox/flox的小鼠作為對(duì)照,分別構(gòu)建兩種腎小球疾病足細(xì)胞損傷模型。通過(guò)PAS染色和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察小鼠腎小球形態(tài)和足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)DGKE組腎小球疾病模型動(dòng)物腎小球系膜基質(zhì)增生和腎小球硬化現(xiàn)象明顯減少,且足細(xì)胞中足突的融合、脫落程度亦顯著減輕。使用免疫熒光法標(biāo)記足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白Nephrin和Podocin,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)DGKE可部分糾正腎小球疾病模型動(dòng)物足細(xì)胞中結(jié)構(gòu)蛋白Nephrin和Podocin的降低。體外培養(yǎng)人足細(xì)胞,轉(zhuǎn)染攜帶DGKE全長(zhǎng)基因序列的腺病毒,結(jié)果顯示,足細(xì)胞過(guò)表達(dá)DGKE可以顯著降低PAN和ADR等腎毒性藥物引起的細(xì)胞損傷以及結(jié)構(gòu)蛋白的缺失。這些結(jié)果表明DGKE對(duì)腎小球疾病足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。3.DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制初探我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot的方法發(fā)現(xiàn)腎小球疾病模型動(dòng)物腎皮質(zhì)中TRPC6的mRNA和蛋白水平顯著高于對(duì)照組,而足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)DGKE后可降低TRPC6的表達(dá),且DGKE足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)也可以降低由損傷引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。說(shuō)明DGKE對(duì)腎小球疾病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與下調(diào)TRPC6的表達(dá)有關(guān),但本研究中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化是否確實(shí)由DGKE對(duì)TRPC6的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。考慮到DGKE的激酶活性,我們也對(duì)足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)DGKE動(dòng)物的腎皮質(zhì)進(jìn)行了蛋白磷酸化質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示,腎小球足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)DGKE動(dòng)物腎小球中卷曲螺旋蛋白37(coiled-coil domain containing 37,CCDC37)出現(xiàn)了絲氨酸磷酸化。進(jìn)一步使用免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP),我們發(fā)現(xiàn)DGKE與CCDC37之間確實(shí)存在相互作用。由于目前CCDC37蛋白的生物學(xué)功能尚不明確,DGKE對(duì)腎小球疾病足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是否與其對(duì)CCDC37的磷酸化調(diào)控有關(guān)有待于進(jìn)一步研究。結(jié)論及創(chuàng)新性本課題首次通過(guò)條件性過(guò)表達(dá)模式動(dòng)物結(jié)合體外轉(zhuǎn)染技術(shù),明確DGKE在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,并初步探討其作用機(jī)制。本研究將為腎小球疾病及其他足細(xì)胞損傷性腎臟疾病的病因研究和干預(yù)策略提供新的思路,具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑第一部分ＤＧＫＥ在腎小球疾病足細(xì)胞損傷中的表達(dá)逡逑１．嘌呤霉素氨基核苷腎病小鼠腎皮質(zhì)的表征逡逑尿液離心后使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定白蛋白和尿肌酐，，以尿白蛋白（ＵＡＣＲ）比值（圖ｌａ）判定腎小球疾病模型是否成功。結(jié)果顯示與正常比，ＰＡＮ處理組小鼠的尿白蛋白肌酐比值明顯升高。進(jìn)一步通過(guò)ＰＡＳ邋（圖透射電鏡（圖ｌｃ）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎小球出現(xiàn)系膜X椛約白閬赴閫蝗諍系認(rèn)窒�。辶x

本文編號(hào)：2705374