【摘要】：精子發(fā)生是一個極其復(fù)雜的細(xì)胞分化過程,主要包括精原干細(xì)胞的增殖分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子形成三個階段。在這一復(fù)雜的過程中,涉及了多種基因調(diào)控和蛋白表達修飾變化,除了可以在轉(zhuǎn)錄水平研究基因表達的蛋白功能外,在蛋白水平研究蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也具有重要意義。組蛋白翻譯后修飾包括乙�；�、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。這些翻譯后修飾在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)重塑、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA的損傷修復(fù)等生命過程中發(fā)揮著極其重要的作用。配子生成素結(jié)合蛋白2(Gametogenetin binding protein 2,GGNBP2),又稱鋅指蛋白403,是配子生成素(GGN)的結(jié)合蛋白,在睪丸組織中高表達,酵母雙雜交實驗證實GGNBP2能夠與GGN1、GGNBP1以及OAZ3相互作用,在精子發(fā)生過程中起決定作用。我們前期工作發(fā)現(xiàn)Ggnbp2基因敲除引起雄性小鼠無精子癥,生精過程阻滯于精子細(xì)胞,生精上皮管腔完整性破壞,精子頂體、核仁畸形。本課題擬在此基礎(chǔ)上,體內(nèi)外實驗進一步研究GGNBP2和GGN1(GGN蛋白最大異構(gòu)體)在精母細(xì)胞減數(shù)分裂,DNA雙鏈斷裂修復(fù)中作用,以及GGNBP2在調(diào)控組蛋白翻譯后修飾的分子機制。研究結(jié)果如下:(1)相互免疫共沉淀證實GGNBP2與GGN1互作,兩種蛋白共同定位于小鼠精母細(xì)胞和精子細(xì)胞(Golgi phase,Cap phase)細(xì)胞核和胞漿,精子細(xì)胞(Acrosome phase,Maturation phases)頂體和尾部,GGNBP2缺失引起幼齡和成年小鼠睪丸組織GgnmRNA水平和蛋白水平減低,免疫熒光顯示GGN1表達更加局限于細(xì)胞核,胞漿染色熒光強度顯著減弱。流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR顯示基因敲除組睪丸生殖細(xì)胞單倍體細(xì)胞數(shù)量減少,而四倍體細(xì)胞數(shù)量增加。(2)成功構(gòu)建Ggnbp2和Ggn基因敲除的體外精母細(xì)胞(GC-2spd),XTT和流式細(xì)胞術(shù)顯示Ggnbp2和Ggn基因敲除在32℃條件下能抑制GC-2spd細(xì)胞增殖和分化,37℃條件下對細(xì)胞增殖無影響,但仍能抑制精母細(xì)胞分化為單倍體細(xì)胞。Ggnbp2基因敲除降低Ggn mRNA和蛋白表達。過表達Ggnbp2能恢復(fù)Ggnbp2KO細(xì)胞Ggn基因和蛋白的水平,也能部分恢復(fù)分化功能,而對GgnKO細(xì)胞的分化功能無影響。(3)免疫共沉淀顯示GGNBP2能與DNA修復(fù)蛋白FANCL、RAD51、RAD18相互作用。Ggnbp2基因敲除不影響聯(lián)會復(fù)合體(SYCP3/SYCP1)染色改變,而粗線期和雙線期精母細(xì)胞g-H2AX彌散分布于所有染色體,而不局限于XY小體上;RAD51在XY小體染色無明顯差異,而常染色體染色熒光點顯著增加;RAD18除XY小體外,其他部位均可見點狀表達,而BRCC36 foci顯著增加。(4)體內(nèi)外實驗均顯示Ggnbp2基因敲除上調(diào)組蛋白H2A_(K119)泛素化水平。免疫共沉淀實驗顯示GGNBP2與多梳蛋白家族成員ASXL1作用,而不與去泛素化酶BAP1相互作用,該蛋白缺失影響ASXL1與BAP1相互作用,而不影響其蛋白表達。同時Ggnbp2基因敲除對ASXL1的染色定位無影響,但能改變BAP1定位,引起B(yǎng)AP1聚集于胞漿,在細(xì)胞核內(nèi)不表達。(5)體內(nèi)外實驗均顯示Ggnbp2基因敲除下調(diào)組蛋白H2B_(K120)泛素化水平。免疫共沉淀實驗,結(jié)果提示GGNBP2與泛素結(jié)合酶E2 B(UBE2B)相互作用,而不與泛素連接酶E3 RNF40相互作用。GGNBP2蛋白缺失能阻斷UBE2B與RNF40相互作用,同時上調(diào)UBE2B表達,而不影響RNF40蛋白表達。(6)GGNBP2蛋白不與泛素特異性蛋白酶超家族(USP)相互作用,但Ggnbp2基因敲除下調(diào)特異性H2A_(K119)去泛素化酶下調(diào)特異性H2A_(K119)去泛素化酶USP16、USP21和非特異性去泛素化酶USP3、USP22表達,而不影響H2B_(K120)去泛素化酶UBP10、USP7表達。本研究得出以下結(jié)論:1.GGNBP2作為GGN結(jié)合蛋白,與GGN共同定位于精母細(xì)胞胞核和胞漿以及精子細(xì)胞的頂體和尾部,在小鼠精子細(xì)胞分化以及精母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。2.Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷可能與GGN1參與的減數(shù)分裂過程中DNA雙鏈損傷修復(fù)機制受損有關(guān)。3.組蛋白泛素化修飾在DNA雙鏈損傷修復(fù)機制中發(fā)揮重要作用。GGNBP2可能通過調(diào)控去泛素化酶復(fù)合體ASXL1/BAP1結(jié)合,或者泛素特異性蛋白酶USP表達影響組蛋白H2A_(K119)去泛素化。同時GGNBP2通過影響泛素結(jié)合酶E2B和泛素連接酶RNF40相互作用,調(diào)控組蛋白H2B_(K120)泛素化水平。
【圖文】：

圖 1.2.3 組蛋白結(jié)構(gòu)圖。負(fù)責(zé)組蛋白 H2A，H2B 泛素化和去泛素化酶（H3、H4 甲基化、乙酰化位點已標(biāo)出）組蛋白 H2A 賴氨酸 119 位點泛素化于 1977 年首次被發(fā)現(xiàn)[40]。它由一些多梳抑制復(fù)合體 1（Polycomb repressive complex 1,PRC1）催化亞基蓄積[41]。多梳蛋白抑制復(fù)合體（PRC1/PRC2）一直被認(rèn)為是發(fā)育和基因轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控因子，由多種不同亞基構(gòu)成，表現(xiàn)為不同的酶活性[42]。PRC1 可以泛素化 H2A 賴氨酸 119 位點[41]。PRC2 催化 H3 賴氨酸 27位點三甲基化[43]。多梳蛋白其生物學(xué)功能作用廣泛，已被證實主要其亞基組成發(fā)揮重要功能[42]。PRC1 和 PRC2 的募集是一個逐級漸進的過程�；� PRC1 復(fù)合體通過其 CBX 蛋白識別 H3K27me3，，推測 PRC2 甲基化目標(biāo)染色質(zhì)，從而使 PRC1 募集并催化 H2AK119位點泛素化，導(dǎo)致基因沉默[44-46]。而最近研究發(fā)現(xiàn) PRC2 募集依賴于 PRC1 活性[47, 48]。H2AK119位點泛素化對 PRC2 募集至關(guān)重要，PRC1 通過其 KDM2B 亞基依附于非甲基化 CpG 島，改變募

第 1 章 緒論生過程有絲分裂時期, 在組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase, HAT)催化下, 組蛋白 H3、 H4 能夠呈高度乙�；癄顟B(tài)[91]，乙�；c組蛋白 H4 上的賴氨酸殘基結(jié)合, 并中和其所帶正電荷，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，同時易于與轉(zhuǎn)錄因子等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白結(jié)合[92]，協(xié)同組蛋白甲基化改變，共同促進基因的轉(zhuǎn)錄。而在減數(shù)分裂時期，在組蛋白去乙酰化酶(Histondeacetylase, HDAC)作用下，組蛋白 H3、 H4 呈現(xiàn)低乙酰化狀態(tài)[93, 94]。精子形成時期，組蛋白 H4 重新被乙酰化，使核小體形成一個比較寬松的結(jié)構(gòu)，易于精蛋白替代組蛋白[95, 96]，高乙�；� H4 出現(xiàn)于早期的長形精子細(xì)胞，從整體上影響著細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，而這種影響會隨著精子細(xì)胞的拉伸和壓縮期而發(fā)生改變，最后隨著核高度壓縮的精子向附睪遷移。1.2.9 組蛋白的甲基化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R698.2

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本文編號：2700986