【摘要】：膀胱癌(Bladder cancer,BC)作為目前臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,其在男性癌瘤發(fā)病率中排名第七位,在女性癌癥發(fā)病率排名第十七位。近年來(lái)因化工產(chǎn)品職業(yè)暴露因素及環(huán)境污染問(wèn)題的加重,膀胱癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年攀高趨勢(shì)。以往普遍認(rèn)為環(huán)境因素在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但近些年研究證實(shí)遺傳因素同樣在膀胱癌進(jìn)展過(guò)程中有著不可忽視的作用,與沒有膀胱癌家族史人群相比,膀胱癌患者直系親屬發(fā)病率顯著增加,提示個(gè)體基因易感性與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān),表明遺傳易感性與環(huán)境因素可通過(guò)交互作用共同參與調(diào)控膀胱癌病理機(jī)制。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是廣泛存在于生物體基因組中的一種核苷酸多態(tài)性,即在不同物種個(gè)體間,基因組DNA序列同一位置上的單個(gè)核苷酸發(fā)生替代、插入或缺失等變異,使得相同位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸發(fā)生改變,當(dāng)這種等位基因突變頻率0.01時(shí)即可被定義為SNP位點(diǎn),各國(guó)學(xué)者普遍認(rèn)可SNP是引發(fā)個(gè)體疾病易感差異性的遺傳學(xué)基礎(chǔ),對(duì)不同基因單核苷酸多態(tài)性探索已成為目前疾病和環(huán)境基因組學(xué)研究的核心內(nèi)容。目前,針對(duì)膀胱癌基因易感性國(guó)內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量的研究,多個(gè)與膀胱癌相關(guān)的基因突變位點(diǎn)得到了確認(rèn)�；瘜W(xué)致癌物作為誘發(fā)膀胱癌的關(guān)鍵性風(fēng)險(xiǎn)因子,吸煙與特定致癌物的職業(yè)暴露為罹患膀胱癌的主要危險(xiǎn)因素,尤其是長(zhǎng)期暴露于芳香胺類、多環(huán)芳烴及氯化烴等致癌物。這些物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)后需在肝臟內(nèi)經(jīng)多種生物酶作用后使其結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的改變,最終以原型或代謝產(chǎn)物形式(有活性或無(wú)活性)被清除。一般來(lái)講其在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程包括兩個(gè)階段,分別為Ⅰ相代謝即為氧化、還原和水解過(guò)程,第二階段為Ⅱ相代謝即通過(guò)結(jié)合作用。涉及Ⅰ相代謝酶類主要是細(xì)胞色素P(cytochrome P,CYP)450酶系,CYP1A2作為CYP酶系超家族的重要成員之一,研究顯示其在諸多藥物和致癌物所致疾病的發(fā)生過(guò)程中有著重要作用,CYP1A2催化底物多為一些極性較大、分子量低或致癌性物質(zhì)包括芳香胺類、鹵代烴類化合物及亞硝胺類,在其催化作用下上述物質(zhì)可經(jīng)氧化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎疚锘蛑掳┪镎T發(fā)多種毒性作用。CYP1A2定位于15號(hào)染色體基因上,其中位于內(nèi)含子1的-163位點(diǎn)rs762551在中國(guó)人的發(fā)生率比較高。以往研究顯示CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。鑒于芳香胺類、多環(huán)芳烴等致癌物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)作用,而CYP1A2與上述物質(zhì)的解毒清除過(guò)程密切相關(guān),我們推測(cè)CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。到目前為止,關(guān)于我國(guó)人群中CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性與膀胱癌易感性相關(guān)性研究尚屬空白。因此本課題旨在通過(guò)病例一對(duì)照分析,探討染色體CYP1A2 rs762551區(qū)域基因多態(tài)性與中國(guó)人群膀胱癌發(fā)病相關(guān)性,實(shí)驗(yàn)將研究對(duì)象限定在中國(guó)漢族人群膀胱癌患者,并且按照膀胱癌國(guó)際多學(xué)科分類將病例重新進(jìn)行病理分型后,以探討該位點(diǎn)多態(tài)性與膀胱癌患者的性別、吸煙狀態(tài)、病理類型及TNM臨床分期等相關(guān)性,并進(jìn)一步明確該多態(tài)性基因與膀胱癌患者預(yù)后關(guān)聯(lián)性,同時(shí)探討該基因多態(tài)性對(duì)CYP1A2活性的影響,以期今后為膀胱癌高危人群的篩查、早期診斷和個(gè)體化治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。研究目的探討染色體CYP1A2 rs762551區(qū)域基因多態(tài)性與中國(guó)人群膀胱癌發(fā)病相關(guān)性;明確該位點(diǎn)多態(tài)性與膀胱癌患者的性別、吸煙狀態(tài)、病理類型及TNM臨床分期等相關(guān)性;分析該多態(tài)性基因與膀胱癌患者預(yù)后關(guān)聯(lián)性;探索該基因多態(tài)性對(duì)CYP1A2活性的可能影響。研究方法1.收集200例正常對(duì)照和200例膀胱癌患者血液標(biāo)本,提取基因組DNA。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)的分析方法,對(duì)正常對(duì)照組和膀胱癌患者樣本CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,明確其基因型分布,應(yīng)用卡方檢驗(yàn)和Logistic回歸分析探討該位點(diǎn)基因型與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。2.應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析CYP1A2基因rs762551多態(tài)性基因頻率與我國(guó)膀胱癌患者病理分期、分級(jí)相關(guān)性,明確CYP1A2多態(tài)性rs762551基因型膀胱癌患者術(shù)后進(jìn)展及復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)性。3.選取健康體檢人群,經(jīng)PCR-RFLP技術(shù)對(duì)CYP1A2 rs762551多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè),分別選取CYP1A2-163C位點(diǎn)CC、CA、AA基因型患者各10例,共30例患者,口服咖啡因后,4 h后采集靜脈血,RP-HPLC法檢測(cè)各受試組探藥濃度以及相應(yīng)代謝產(chǎn)物的濃度,采用1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因的比值來(lái)表示CYP1A2的活性,對(duì)比分析CYP1A2多態(tài)性rs762551基因型人群CYP1A2酶活性的差異性。結(jié)果1.選取研究對(duì)象412例,膀胱癌組共212例患者,其中男性127例,占病例組人數(shù)的59.91%,女性患者85例,占40.09%,膀胱癌組人群平均年齡為63.71±15.63歲;對(duì)照組200例,其中男性135例,占對(duì)照組人數(shù)的67.50%,女性65例,占比32.50%,兩組人群在年齡構(gòu)成及性別構(gòu)成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外病例組人群中飲酒者及吸煙所占比例與對(duì)照組人群無(wú)顯著性差異。評(píng)估膀胱癌患者組腫瘤進(jìn)展程度,可見膀胱癌患者組中低級(jí)別患者和高級(jí)別患者分別為87例和125例,占比為41.04%和58.96%。非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌(NMIBC)患者和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC)患者分別為123例和89例,占膀胱癌患者組總?cè)藬?shù)的58.02%和41.98%。2.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組共納入412例研究對(duì)象,其中病例組212例,對(duì)照組200例,PCR-RFLP法分型檢測(cè)CYP1A2基因rs762551位點(diǎn),共檢測(cè)到野生型(C/C)、突變雜合子(C/A)、突變純合子(A/A)三種基因型。分析結(jié)果顯示膀胱癌患者組及對(duì)照組中CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)三種基因型所占比例分別為:對(duì)照組 CC 64.00%(128/200)、CA 27.50%(55/200)、AA 8.50%(17/200);膀胱癌患者組 CC 34.91%(74/212)、CA 41.98%(89/212)、AA 23.11%(49/212)。各等位基因在各組中的分布率分別為:對(duì)照組人群中C和A等位基因占比分別為77.75%和22.25%;膀胱癌患者組中C等位基因占55.90%,A等位基因占44.10%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示膀胱癌患者組中CC基因型頻率明顯低于對(duì)照組(34.91%vs.64.00%),但CA和AA基因型在膀胱癌患者組中分布頻率明顯高于對(duì)照組;與正常組相比,C等位基因在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率較低,上述結(jié)果證實(shí)膀胱癌患者組和正常人群組中CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)的基因頻率和等位基因頻率存在顯著性差異。3.Logistic回歸分析顯示CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)A等位基因(CA+AA)攜帶者人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性高于CC基因型攜帶人群(OR=3.72,95%CI:1.55-7.16,P=0.02)。對(duì)比A與C等位基因分布頻率,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于C等位基因,A等位基因與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性存在明確相關(guān)性(C與A:OR=4.89,95%CI:2.78-10.87,P= 0.01)。4.我們依據(jù)膀胱尿路上皮癌病理分級(jí)(低級(jí)別vs高級(jí)別)對(duì)其與單核苷酸多態(tài)性rs762551相關(guān)性進(jìn)行分析。在低級(jí)別膀胱癌患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為43.68%(38/87)、17.24%(15/87)和39.08%(34/87);高級(jí)別患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為28.80%(36/125)、27.20%(34/125)和44.0%(55/125),低級(jí)別膀胱癌患者組AA基因型頻率明顯低于高級(jí)別組(P=0.02);Logistic回歸統(tǒng)計(jì)分析顯示,在校正年齡、性別及吸煙史等因素后,CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)含有A等位基因的基因型(CA及AA)患者其高級(jí)別膀胱癌(OR=1.92,95%CI=1.08-3.40,P=0.02)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性顯著上升。5.我們探討了rs762551位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌患者病理分期(NMIBC vs MIBC)相關(guān)性,123例NMIBC癌患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為32.52%(40/123)、47.15%(58/123)和20.33%(25/123);89例MIBC患者組中,CC、AA 及CA基因型占比分別為38.20%(34/89)、34.83%(31/89)和26.70%(24/89),NMIBC患者組CC、AA及CA三種基因型頻率與MIBC患者組無(wú)明顯差別(P=0.02);Logistic回歸統(tǒng)計(jì)分析顯示,在校正年齡、性別及吸煙史等因素后,CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)含有A等位基因的基因型(CA及AA)與膀胱癌病理分期無(wú)明顯相關(guān)性。6.本研究中我們對(duì)212例膀胱癌患者預(yù)后進(jìn)行了隨訪,共計(jì)205例完成了全部隨訪,7例失訪,隨訪期內(nèi)無(wú)病患死亡。參照預(yù)后情況(腫瘤復(fù)發(fā)及進(jìn)展)對(duì)患者進(jìn)行分組設(shè)為復(fù)發(fā)組與無(wú)復(fù)發(fā)組、進(jìn)展組與無(wú)進(jìn)展組,對(duì)比分析兩組患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期和腫瘤分級(jí)等臨床病理資料,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下:膀胱癌患者組中腫瘤復(fù)發(fā)與無(wú)復(fù)發(fā)人數(shù)所占比例分別為34.6%(71/205)和65.4%(134/205);兩組患者在年齡構(gòu)成(≤65 vs≥65)、性別比例(男vs女)、吸煙狀況(吸煙vs未吸煙)、腫瘤分期(NMIBC vs MIBC)和腫瘤分級(jí)(低級(jí)別vs高級(jí)別)臨床特征上均無(wú)明顯差異(P0.05)。腫瘤進(jìn)展患者組與無(wú)進(jìn)展患者組病例占比例分別為14.6%(30/205)和85.4%(175/205),兩組間患者在年齡構(gòu)成(≤65 vs≥65)、性別(男vs女)臨床特征上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但在吸煙狀況(吸煙vs未吸煙)、腫瘤分期(NMIBC vs MIBC)和腫瘤分級(jí)(低級(jí)別vs高級(jí)別)存在明顯差異(P0.05)。7.分析復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)患者組rs762551位點(diǎn)CC基因型與AA/CA基因型分布頻率,可見CC基因型患者組在復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)人數(shù)中所占比例分別為29.17%(21/72)和70.83%(51/72),AA患者組在復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)人數(shù)中所占比例分別為39.58%(19/48)和64.71%(29/48),CA基因型復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)人數(shù)中所占比例分別為35.29%(30/85)和64.71%(55/85),復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)患者組中CC與AA/CA基因分布頻率無(wú)明顯差異(P=0.240.41),而在腫瘤進(jìn)展(進(jìn)展vs未進(jìn)展)的CC基因型與AA基因型在頻率分布上則可見顯著性差異(P=0.01),CC基因型患者組在腫瘤進(jìn)展與未進(jìn)展人數(shù)中所占比例分別為6.94%(5/72)和93.06%(67/72),AA基因型患者組在腫瘤進(jìn)展與未進(jìn)展人數(shù)中所占比例分別為12.94%(11/85)和87.05%(74/85),CA基因型患者組在腫瘤進(jìn)展與未進(jìn)展人數(shù)中所占比例分別為29.17%(14/48)和70.83%(34/48)。等位基因分析結(jié)果顯示,腫瘤復(fù)發(fā)患者組rs762551位點(diǎn)CC基因型與A基因攜帶患者分布頻率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.240.41),提示與rs762551位點(diǎn)A基因型攜帶者相比,rs762551位點(diǎn)CC基因型可一定程度預(yù)防膀胱癌患者病情惡化進(jìn)展。8.受試者口服咖啡因4 h后,高效液相色譜法測(cè)定不同受試組人群血清中咖啡因及其代謝產(chǎn)物濃度,采用1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因的比值來(lái)表示CYP1A2 的活性,結(jié)果顯示CYP1A2 rs762551位點(diǎn)CC、CA及AA組CYP1A2平均活性為分別為(2.91±1.09)、(3.27±1.24)和(4.68±2.35),與 CC組相比,AA組CYP1A2平均酶活性提高了 60.8%,提示CYP1A2 rs762551位點(diǎn)AA基因型可增強(qiáng)個(gè)體CYP1A2酶活性。9.使用不同濃度的AαC(0、20、40、60、80 μg/mL)對(duì)處理SV-HUC-1細(xì)胞24 h后測(cè)定細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示SV-HUC-1細(xì)胞存活率與AαC處理濃度表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系,伴隨AαC處理劑量的增加,SV-HUC-1細(xì)胞存活率也不斷降低。AαC 對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞IC50為(55.43±3.98)μg/mL,為了明確AαC對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞的可能影響途徑,后續(xù)研究中我們選擇20、40和60μg/mL AαC用于細(xì)胞處理。10.SV-HUC-1細(xì)胞分別給與20、40和60 μg/mL AαC干預(yù)6 h后,與對(duì)照組相比,20、40和60 μg/mL AαC可致SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈現(xiàn)不同程度增加,以上結(jié)果表明AαC可促進(jìn)SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)源性ROS的生成,產(chǎn)生應(yīng)激效應(yīng)。11.20、40和60 μg/mL AαC分別處理SV-HUC-1 細(xì)胞6 h后,測(cè)定SV-HUC-1細(xì)胞GSH/GSSG比率,與對(duì)照組相比,AαC處理組SV-HUC-1細(xì)胞GSH/GSSG比率降低(P0.05或P0.01),表明AαC處理可致SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)GSH大量消耗,使GSSG過(guò)度累積,提示AαC可致細(xì)胞氧化應(yīng)激程度增加。12.與對(duì)照組細(xì)胞相比,經(jīng)20、40和60 μg/mL AαC處理后,SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平顯著增加,且伴隨AαC作用劑量的增加,8-OHdG水平也逐漸遞增,提示AαC處理可致SV-HUC-1細(xì)胞DNA損傷。結(jié)論1.CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有明確的相關(guān)性。2.CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌性別、年齡、病理分期等臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性,但與膀胱癌患者病理分級(jí)相關(guān)。3.CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)CC基因型攜者與其它基因型相比,有著更長(zhǎng)的PFS,但與短期復(fù)發(fā)沒有顯著相關(guān)性。4.本研究發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因rs762551位點(diǎn)發(fā)生C→A突變后可增強(qiáng)CYP1A2酶活性,表現(xiàn)為1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因比值的上調(diào),且該促進(jìn)作用僅發(fā)生于-163 A/A突變?nèi)巳骸？芍狢YP1A2基因rs762551位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性,可能與-163 A/A突變后CYP1A2酶活性增強(qiáng),誘發(fā)促前致癌物激活,引發(fā)致癌物大量蓄積于膀胱組織有關(guān)。5.AαC對(duì)正常膀胱上皮細(xì)胞的基因毒性作用是通過(guò)氧化應(yīng)激效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的,
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14

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1 宋亞林;單核苷酸多態(tài)性rs762551與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性研究[D];山東大學(xué);2019年

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本文編號(hào)：2693487