發(fā)布時間：2020-06-02 17:01

【摘要】：膀胱癌(Bladder cancer,BC)作為目前臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,其在男性癌瘤發(fā)病率中排名第七位,在女性癌癥發(fā)病率排名第十七位。近年來因化工產品職業(yè)暴露因素及環(huán)境污染問題的加重,膀胱癌的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年攀高趨勢。以往普遍認為環(huán)境因素在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,但近些年研究證實遺傳因素同樣在膀胱癌進展過程中有著不可忽視的作用,與沒有膀胱癌家族史人群相比,膀胱癌患者直系親屬發(fā)病率顯著增加,提示個體基因易感性與膀胱癌的發(fā)生密切相關,表明遺傳易感性與環(huán)境因素可通過交互作用共同參與調控膀胱癌病理機制。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)是廣泛存在于生物體基因組中的一種核苷酸多態(tài)性,即在不同物種個體間,基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸發(fā)生替代、插入或缺失等變異,使得相同位點上單個核苷酸發(fā)生改變,當這種等位基因突變頻率0.01時即可被定義為SNP位點,各國學者普遍認可SNP是引發(fā)個體疾病易感差異性的遺傳學基礎,對不同基因單核苷酸多態(tài)性探索已成為目前疾病和環(huán)境基因組學研究的核心內容。目前,針對膀胱癌基因易感性國內外學者已進行了大量的研究,多個與膀胱癌相關的基因突變位點得到了確認�；瘜W致癌物作為誘發(fā)膀胱癌的關鍵性風險因子,吸煙與特定致癌物的職業(yè)暴露為罹患膀胱癌的主要危險因素,尤其是長期暴露于芳香胺類、多環(huán)芳烴及氯化烴等致癌物。這些物質進入體內后需在肝臟內經多種生物酶作用后使其結構發(fā)生不同程度的改變,最終以原型或代謝產物形式(有活性或無活性)被清除。一般來講其在體內的生物轉化過程包括兩個階段,分別為Ⅰ相代謝即為氧化、還原和水解過程,第二階段為Ⅱ相代謝即通過結合作用。涉及Ⅰ相代謝酶類主要是細胞色素P(cytochrome P,CYP)450酶系,CYP1A2作為CYP酶系超家族的重要成員之一,研究顯示其在諸多藥物和致癌物所致疾病的發(fā)生過程中有著重要作用,CYP1A2催化底物多為一些極性較大、分子量低或致癌性物質包括芳香胺類、鹵代烴類化合物及亞硝胺類,在其催化作用下上述物質可經氧化代謝轉變?yōu)槎疚锘蛑掳┪镎T發(fā)多種毒性作用。CYP1A2定位于15號染色體基因上,其中位于內含子1的-163位點rs762551在中國人的發(fā)生率比較高。以往研究顯示CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展相關。鑒于芳香胺類、多環(huán)芳烴等致癌物在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中的風險作用,而CYP1A2與上述物質的解毒清除過程密切相關,我們推測CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性可能與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展存在相關性。到目前為止,關于我國人群中CYP1A2 rs762551基因多態(tài)性與膀胱癌易感性相關性研究尚屬空白。因此本課題旨在通過病例一對照分析,探討染色體CYP1A2 rs762551區(qū)域基因多態(tài)性與中國人群膀胱癌發(fā)病相關性,實驗將研究對象限定在中國漢族人群膀胱癌患者,并且按照膀胱癌國際多學科分類將病例重新進行病理分型后,以探討該位點多態(tài)性與膀胱癌患者的性別、吸煙狀態(tài)、病理類型及TNM臨床分期等相關性,并進一步明確該多態(tài)性基因與膀胱癌患者預后關聯(lián)性,同時探討該基因多態(tài)性對CYP1A2活性的影響,以期今后為膀胱癌高危人群的篩查、早期診斷和個體化治療提供理論依據和數(shù)據基礎。研究目的探討染色體CYP1A2 rs762551區(qū)域基因多態(tài)性與中國人群膀胱癌發(fā)病相關性;明確該位點多態(tài)性與膀胱癌患者的性別、吸煙狀態(tài)、病理類型及TNM臨床分期等相關性;分析該多態(tài)性基因與膀胱癌患者預后關聯(lián)性;探索該基因多態(tài)性對CYP1A2活性的可能影響。研究方法1.收集200例正常對照和200例膀胱癌患者血液標本,提取基因組DNA。利用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)的分析方法,對正常對照組和膀胱癌患者樣本CYP1A2基因rs762551位點進行基因分型,明確其基因型分布,應用卡方檢驗和Logistic回歸分析探討該位點基因型與膀胱癌發(fā)病風險的關系。2.應用卡方檢驗分析CYP1A2基因rs762551多態(tài)性基因頻率與我國膀胱癌患者病理分期、分級相關性,明確CYP1A2多態(tài)性rs762551基因型膀胱癌患者術后進展及復發(fā)關聯(lián)性。3.選取健康體檢人群,經PCR-RFLP技術對CYP1A2 rs762551多態(tài)性位點進行基因分型檢測,分別選取CYP1A2-163C位點CC、CA、AA基因型患者各10例,共30例患者,口服咖啡因后,4 h后采集靜脈血,RP-HPLC法檢測各受試組探藥濃度以及相應代謝產物的濃度,采用1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因的比值來表示CYP1A2的活性,對比分析CYP1A2多態(tài)性rs762551基因型人群CYP1A2酶活性的差異性。結果1.選取研究對象412例,膀胱癌組共212例患者,其中男性127例,占病例組人數(shù)的59.91%,女性患者85例,占40.09%,膀胱癌組人群平均年齡為63.71±15.63歲;對照組200例,其中男性135例,占對照組人數(shù)的67.50%,女性65例,占比32.50%,兩組人群在年齡構成及性別構成無統(tǒng)計學意義(P0.05)。此外病例組人群中飲酒者及吸煙所占比例與對照組人群無顯著性差異。評估膀胱癌患者組腫瘤進展程度,可見膀胱癌患者組中低級別患者和高級別患者分別為87例和125例,占比為41.04%和58.96%。非肌層浸潤性尿路上皮癌(NMIBC)患者和肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)患者分別為123例和89例,占膀胱癌患者組總人數(shù)的58.02%和41.98%。2.實驗組和對照組共納入412例研究對象,其中病例組212例,對照組200例,PCR-RFLP法分型檢測CYP1A2基因rs762551位點,共檢測到野生型(C/C)、突變雜合子(C/A)、突變純合子(A/A)三種基因型。分析結果顯示膀胱癌患者組及對照組中CYP1A2基因rs762551位點三種基因型所占比例分別為:對照組 CC 64.00%(128/200)、CA 27.50%(55/200)、AA 8.50%(17/200);膀胱癌患者組 CC 34.91%(74/212)、CA 41.98%(89/212)、AA 23.11%(49/212)。各等位基因在各組中的分布率分別為:對照組人群中C和A等位基因占比分別為77.75%和22.25%;膀胱癌患者組中C等位基因占55.90%,A等位基因占44.10%。統(tǒng)計結果顯示膀胱癌患者組中CC基因型頻率明顯低于對照組(34.91%vs.64.00%),但CA和AA基因型在膀胱癌患者組中分布頻率明顯高于對照組;與正常組相比,C等位基因在實驗組中的分布頻率較低,上述結果證實膀胱癌患者組和正常人群組中CYP1A2基因rs762551位點的基因頻率和等位基因頻率存在顯著性差異。3.Logistic回歸分析顯示CYP1A2基因rs762551位點A等位基因(CA+AA)攜帶者人群膀胱癌的發(fā)病風險性高于CC基因型攜帶人群(OR=3.72,95%CI:1.55-7.16,P=0.02)。對比A與C等位基因分布頻率,發(fā)現(xiàn)相對于C等位基因,A等位基因與膀胱癌發(fā)病風險性存在明確相關性(C與A:OR=4.89,95%CI:2.78-10.87,P= 0.01)。4.我們依據膀胱尿路上皮癌病理分級(低級別vs高級別)對其與單核苷酸多態(tài)性rs762551相關性進行分析。在低級別膀胱癌患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為43.68%(38/87)、17.24%(15/87)和39.08%(34/87);高級別患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為28.80%(36/125)、27.20%(34/125)和44.0%(55/125),低級別膀胱癌患者組AA基因型頻率明顯低于高級別組(P=0.02);Logistic回歸統(tǒng)計分析顯示,在校正年齡、性別及吸煙史等因素后,CYP1A2基因rs762551位點含有A等位基因的基因型(CA及AA)患者其高級別膀胱癌(OR=1.92,95%CI=1.08-3.40,P=0.02)發(fā)病風險性顯著上升。5.我們探討了rs762551位點單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌患者病理分期(NMIBC vs MIBC)相關性,123例NMIBC癌患者組中,CC、AA及CA基因型占比分別為32.52%(40/123)、47.15%(58/123)和20.33%(25/123);89例MIBC患者組中,CC、AA 及CA基因型占比分別為38.20%(34/89)、34.83%(31/89)和26.70%(24/89),NMIBC患者組CC、AA及CA三種基因型頻率與MIBC患者組無明顯差別(P=0.02);Logistic回歸統(tǒng)計分析顯示,在校正年齡、性別及吸煙史等因素后,CYP1A2基因rs762551位點含有A等位基因的基因型(CA及AA)與膀胱癌病理分期無明顯相關性。6.本研究中我們對212例膀胱癌患者預后進行了隨訪,共計205例完成了全部隨訪,7例失訪,隨訪期內無病患死亡。參照預后情況(腫瘤復發(fā)及進展)對患者進行分組設為復發(fā)組與無復發(fā)組、進展組與無進展組,對比分析兩組患者年齡、性別、吸煙狀況、腫瘤分期和腫瘤分級等臨床病理資料,統(tǒng)計結果如下:膀胱癌患者組中腫瘤復發(fā)與無復發(fā)人數(shù)所占比例分別為34.6%(71/205)和65.4%(134/205);兩組患者在年齡構成(≤65 vs≥65)、性別比例(男vs女)、吸煙狀況(吸煙vs未吸煙)、腫瘤分期(NMIBC vs MIBC)和腫瘤分級(低級別vs高級別)臨床特征上均無明顯差異(P0.05)。腫瘤進展患者組與無進展患者組病例占比例分別為14.6%(30/205)和85.4%(175/205),兩組間患者在年齡構成(≤65 vs≥65)、性別(男vs女)臨床特征上均無統(tǒng)計學差異(P0.05),但在吸煙狀況(吸煙vs未吸煙)、腫瘤分期(NMIBC vs MIBC)和腫瘤分級(低級別vs高級別)存在明顯差異(P0.05)。7.分析復發(fā)及未復發(fā)患者組rs762551位點CC基因型與AA/CA基因型分布頻率,可見CC基因型患者組在復發(fā)與未復發(fā)人數(shù)中所占比例分別為29.17%(21/72)和70.83%(51/72),AA患者組在復發(fā)與未復發(fā)人數(shù)中所占比例分別為39.58%(19/48)和64.71%(29/48),CA基因型復發(fā)與未復發(fā)人數(shù)中所占比例分別為35.29%(30/85)和64.71%(55/85),復發(fā)及未復發(fā)患者組中CC與AA/CA基因分布頻率無明顯差異(P=0.240.41),而在腫瘤進展(進展vs未進展)的CC基因型與AA基因型在頻率分布上則可見顯著性差異(P=0.01),CC基因型患者組在腫瘤進展與未進展人數(shù)中所占比例分別為6.94%(5/72)和93.06%(67/72),AA基因型患者組在腫瘤進展與未進展人數(shù)中所占比例分別為12.94%(11/85)和87.05%(74/85),CA基因型患者組在腫瘤進展與未進展人數(shù)中所占比例分別為29.17%(14/48)和70.83%(34/48)。等位基因分析結果顯示,腫瘤復發(fā)患者組rs762551位點CC基因型與A基因攜帶患者分布頻率無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.240.41),提示與rs762551位點A基因型攜帶者相比,rs762551位點CC基因型可一定程度預防膀胱癌患者病情惡化進展。8.受試者口服咖啡因4 h后,高效液相色譜法測定不同受試組人群血清中咖啡因及其代謝產物濃度,采用1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因的比值來表示CYP1A2 的活性,結果顯示CYP1A2 rs762551位點CC、CA及AA組CYP1A2平均活性為分別為(2.91±1.09)、(3.27±1.24)和(4.68±2.35),與 CC組相比,AA組CYP1A2平均酶活性提高了 60.8%,提示CYP1A2 rs762551位點AA基因型可增強個體CYP1A2酶活性。9.使用不同濃度的AαC(0、20、40、60、80 μg/mL)對處理SV-HUC-1細胞24 h后測定細胞存活率,結果顯示SV-HUC-1細胞存活率與AαC處理濃度表現(xiàn)為劑量依賴關系,伴隨AαC處理劑量的增加,SV-HUC-1細胞存活率也不斷降低。AαC 對SV-HUC-1細胞IC50為(55.43±3.98)μg/mL,為了明確AαC對SV-HUC-1細胞的可能影響途徑,后續(xù)研究中我們選擇20、40和60μg/mL AαC用于細胞處理。10.SV-HUC-1細胞分別給與20、40和60 μg/mL AαC干預6 h后,與對照組相比,20、40和60 μg/mL AαC可致SV-HUC-1細胞內ROS水平呈現(xiàn)不同程度增加,以上結果表明AαC可促進SV-HUC-1細胞內源性ROS的生成,產生應激效應。11.20、40和60 μg/mL AαC分別處理SV-HUC-1 細胞6 h后,測定SV-HUC-1細胞GSH/GSSG比率,與對照組相比,AαC處理組SV-HUC-1細胞GSH/GSSG比率降低(P0.05或P0.01),表明AαC處理可致SV-HUC-1細胞內GSH大量消耗,使GSSG過度累積,提示AαC可致細胞氧化應激程度增加。12.與對照組細胞相比,經20、40和60 μg/mL AαC處理后,SV-HUC-1細胞內8-OHdG水平顯著增加,且伴隨AαC作用劑量的增加,8-OHdG水平也逐漸遞增,提示AαC處理可致SV-HUC-1細胞DNA損傷。結論1.CYP1A2基因rs762551位點單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風險具有明確的相關性。2.CYP1A2基因rs762551位點單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌性別、年齡、病理分期等臨床特征無明顯相關性,但與膀胱癌患者病理分級相關。3.CYP1A2基因rs762551位點CC基因型攜者與其它基因型相比,有著更長的PFS,但與短期復發(fā)沒有顯著相關性。4.本研究發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因rs762551位點發(fā)生C→A突變后可增強CYP1A2酶活性,表現(xiàn)為1,7二甲基黃嘌呤與咖啡因比值的上調,且該促進作用僅發(fā)生于-163 A/A突變人群。可知CYP1A2基因rs762551位點單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌風險相關性,可能與-163 A/A突變后CYP1A2酶活性增強,誘發(fā)促前致癌物激活,引發(fā)致癌物大量蓄積于膀胱組織有關。5.AαC對正常膀胱上皮細胞的基因毒性作用是通過氧化應激效應實現(xiàn)的,
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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1 宋亞林;單核苷酸多態(tài)性rs762551與膀胱癌發(fā)病風險及預后的關聯(lián)性研究[D];山東大學;2019年

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本文編號：2693487