【摘要】：機體通過排尿活動將代謝廢物排出體外,從而達到維持正常生命活動和體液平衡的目的。膀胱正常的生理功能是存儲尿液和排空尿液,其神經調控機制極其復雜,需要在大腦、脊髓及外周神經系統(tǒng)的共同精細調控下完成。上述任意層面的損傷或病變,均可能引起神經源性膀胱功能障礙(neurogenic bladder dysfunction,NGB)。許多患有神經系統(tǒng)疾病的病人,如多發(fā)性硬化癥、帕金森病、脊髓損傷和脊柱裂等,都伴有神經源性膀胱功能障礙。NGB常見的臨床癥狀主要表現為尿頻、尿急、尿失禁,有些患者甚至無法排尿以及伴有上尿路的感染。然而,我們現階段對神經源性膀胱功能障礙的認識仍十分有限,其發(fā)病機理和病理生理過程亟待進一步研究。故深入解析調控膀胱的神經網絡、探究生理性排尿行為的神經編碼模式,將為神經源性膀胱功能障礙的診斷和治療提供新的策略。全面解析大腦與膀胱間的神經環(huán)路結構,是研究大腦調控膀胱功能及相關病理生理機制的基石。近年來神經解剖示蹤技術發(fā)展迅速,一種名為偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)的皰疹病毒橫空出世,該病毒可以逆行跨越多級突觸結構,使解析外周臟器與大腦之間的神經傳導通路成為可能。此外,探究調控膀胱或排尿活動相關腦區(qū)的神經編碼模式,是解析大腦調控膀胱和排尿活動神經機制的最佳策略。隨著基因編碼鈣離子指標劑(genetically encoded Ca~(2+)indicators,GECIs)和基因靶向技術的發(fā)展,基于光纖的神經鈣活動探測技術(又稱為光纖光度法)成為了當下最流行的解析神經活動模式的研究技術。該方法可以在自由活動且清醒小鼠任意腦區(qū)進行神經元集群活動的監(jiān)測。光纖光度法主要通過檢測神經元集群的鈣活動(鈣信號),來反映這群神經元的平均簇狀放電活動和動作電位發(fā)放水平。與傳統(tǒng)的電生理技術相比,它具有易于上手、實驗成本低和數據分析便捷等優(yōu)勢。通過運用上述兩項技術,本課題旨在解析中樞神經系統(tǒng)與膀胱之間的神經環(huán)路連接結構,并揭示腦橋排尿中樞(pontine micturition center,PMC)神經元集群在排尿活動和膀胱不同狀態(tài)下的活動特征和機制。我們主要開展了以下實驗:(1)為了明確參與支配膀胱逼尿肌的神經元在脊髓和外周神經的分布情況,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,我們對其脊髓和膀胱組織進行切片和免疫組化處理,再使用共聚焦顯微成像技術觀測PRV-EGFP標記的細胞在切片中的分布;或者運用熒光顯微切片斷層成像(Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography,fMOST)技術直接對小鼠脊髓組織進行連續(xù)切片和熒光圖片采集。(2)為了明確參與支配膀胱逼尿肌的腦區(qū)分布,雄性小鼠膀胱注射PRV-EGFP4.5-5天后,我們對其腦組織進行切片和免疫組化處理,再使用共聚焦顯微成像技術觀測PRV-EGFP標記的細胞在切片中的分布,或者運用fMOST技術直接對腦組織進行連續(xù)切片和熒光圖片采集。為了明確雌性和雄性小鼠參與支配膀胱逼尿肌的腦區(qū)分布是否有差別,我們分別對雌性和雄性小鼠的膀胱進行了PRV-EGFP注射。為了明確膀胱感染PRV不同時間點對PRV腦內標記的影響,我們分別獲取了膀胱感染PRV-EGFP3天、4天和4.5至5天的小鼠腦組織。為了明確參與支配膀胱逼尿肌不同部位的腦區(qū)是否存在差異,我們分別將PRV-EGFP和PRV-RFP注射入膀胱左右側壁內。(3)為了明確參與支配膀胱逼尿肌的大腦皮層區(qū)域的具體定位,我們運用fMOST技術對PRV-EGFP標記的皮層區(qū)域進行連續(xù)切片和數據采集,并觀測PRV-EGFP標記的皮層區(qū)域的具體位置;或者使用共聚焦顯微成像技術觀測PRV-EGFP標記的皮層區(qū)域的具體位置。(4)為了明確參與支配膀胱逼尿肌的PMC區(qū)的精準坐標,我們將共聚焦采集到的PMC形態(tài)學結果與經典小鼠腦圖譜進行對比。為了明確PMC的上游腦區(qū),我們通過腦內病毒注射技術將腺相關病毒(AAV-Retro-hSyn-EYFP)注射入小鼠的PMC腦區(qū)內,病毒表達一個月后,我們對小鼠腦組織進行切片,并使用共聚焦顯微成像技術觀測PRV-EGFP標記的細胞在腦內的分布。(5)為了明確PMC神經元集群的活動是否與清醒自由運動小鼠的排尿活動相關聯(lián),我們運用基于光纖的神經鈣活動記錄技術來探測PMC神經元集群的活動,并同步記錄小鼠的排尿行為。(6)為了明確PMC神經元集群的活動是誘發(fā)小鼠排尿活動所必須的條件,我們通過將GABA受體的激動劑(muscimol)注入雙側PMC來阻斷PMC神經元集群的活動,再評估小鼠排尿活動的變化情況。(7)為了明確PMC神經元集群的活動是否與膀胱逼尿肌的收縮相關聯(lián),我們運用基于光纖的神經鈣活動記錄技術來探測PMC神經元集群的鈣活動,并同步記錄小鼠(麻醉狀態(tài)下或清醒自由活動狀態(tài)下)的膀胱壓力。(8)為了進一步驗證PMC神經元集群的活動是否是膀胱逼尿肌收縮所必須的條件,我們運用基于光纖的神經鈣活動記錄技術來探測PMC神經元集群的鈣活動,并同步記錄不同麻醉方式下小鼠的膀胱壓力(異氟烷和烏拉坦)。通過深度氣體麻醉(2.5%異氟烷)的方式來阻斷PMC的神經活動,再評估其對膀胱測壓過程中逼尿肌周期性收縮的影響。主要研究結果:(1)PRV標記的神經元在小鼠脊髓和外周神經中的分布PRV-EGFP標記膀胱內的神經纖維,這些神經纖維來自于外周神經節(jié)內的神經元。在脊髓中,我們發(fā)現在腰骶髓中間外側柱區(qū)域(the intermediolateral area,IML)、背側灰質后連合(the dorsal gray commissure,DGC)和脊髓背角淺層(the superficial dorsal horn,SDH)均有PRV-EGFP標記的神經元;位于IML中的骶髓副交感神經元(the sacral parasympathetic preganglionic neurons,SPN)也感染了PRV-EGFP;在L1-L2中PRV-EGFP感染的神經元主要分布在這些脊髓層面的中間外側柱區(qū)域(IML)和背側灰質后連合(DGC),而頸段脊髓鮮有PRV-EGFP感染的神經元。(n=5只雄性小鼠)(2)PRV標記的神經元在小鼠大腦內的分布PRV-EGFP標記的神經元主要分布在:腦橋排尿中樞(PMC)、網狀核(gigantocellular reticular nucleus,Gi)、髓中縫核(Raphe nuclei)、藍斑核(locus coeruleus,LC)、腦干A5細胞群組、中腦導水管灰質區(qū)(periaqueductal gray,PAG)、紅核(Red nucleus)、下丘腦的內側視前區(qū)(medial preoptic area,MPA)、下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN)、外側下丘腦(lateral hypothalamic area,LH)和部分大腦皮層區(qū)域(n=5只雄性小鼠)。在對照組(PRV-EGFP注射入下腹壁)中,上述腦區(qū)均未發(fā)現PRV標記的神經元(n=3只雄性小鼠)。我們運用fMOST技術和三維重建法,率先繪制出了支配雄性小鼠膀胱逼尿肌相關腦內神經元的三維腦圖譜。同一只雄性小鼠的膀胱左右側壁分別注射PRV-EGFP和PRV-RFP病毒后,兩種PRV感染的主要腦區(qū)相同;雌鼠膀胱注射PRV后,PRV感染的腦區(qū)與雄鼠的結果相同(n=3只小鼠/組)。PRV-EGFP注射3天后,大腦內僅在PMC和Gi區(qū)發(fā)現少量PRV-EGFP標記的神經元;PRV-EGFP注射4天后,上述主要腦區(qū)均出現PRV-EGFP標記的神經元(n=3只雄小鼠/組)。(3)PRV標記的神經元在大腦皮層的分布PRV-EGFP標記的小鼠大腦皮層區(qū)域為初級運動(primary motor cortex,M1)和感覺皮層(primary somatosensory cortex,S1),這些神經元主要位于它們的第五層,從形態(tài)學上判斷它們都是椎體神經元;通過fMOST技術和三維重建,我們明確了整個PRV-EGFP標記的皮層區(qū)域的范圍(前后跨度約為960μm)和PRV-EGFP標記的皮層神經元總數目(約為970個,n=3只雄性小鼠),PRV感染膀胱4天后皮層才出現PRV-EGFP標記的神經元(n=3只雄性小鼠)。上述結果提示皮層是PMC的上游腦區(qū)。(4)PRV標記的神經元在PMC的精確定位和PMC上游腦區(qū)的分布小鼠核心PMC區(qū)的坐標:AP為-5.45 mm,ML為±0.7 mm,DV為-3.15 mm。PMC的上游腦區(qū),主要包括PAG、M1、S1、PVN、LH和前額葉皮層在內的多個腦區(qū),這些區(qū)域內的神經元可以直接投射至PMC(n=3只雄性小鼠)。(5)PMC神經元集群的鈣信號(神經活動)與清醒自由運動小鼠的排尿活動密切相關小鼠自主排尿活動時,實驗組(PMC神經元表達GCaMP6f)小鼠可以穩(wěn)定地記錄到與排尿活動高度相關的鈣信號,而對照組(PMC神經元表達EGFP)小鼠則未記錄到與排尿活動高度相關的鈣信號。定量對比顯示實驗組小鼠排尿過程中PMC神經元集群熒光強度變化的幅值明顯高于對照組(PMC神經元表達GCaMP6f組,maxΔf/f=36.73%±4.90%;PMC神經元表達EGFP組,maxΔf/f=2.24%±0.66%;P0.001;n=7只小鼠/組)。由于對照組小鼠未記錄到明顯的PMC神經元集群熒光強度變化,進一步證實了我們所記錄到的小鼠排尿相關的鈣活動,代表PMC神經元的激活反應,而不是小鼠運動引起的運動噪音或者是“偽信號”。進一步對實驗組小鼠所記錄到的自主排尿活動相關PMC神經元集群鈣信號進行深入分析,我們發(fā)現排尿相關的PMC神經元集群的活動(鈣信號)有以下幾個特點:1.PMC區(qū)神經元集群鈣信號的起始早于小鼠排尿活動的起始,提前的時間約為402±21 ms;2.實驗組小鼠每次排尿活動都能記錄到對應的PMC區(qū)神經元集群的鈣信號,而對照組動物每次排尿活動都不能記錄到PMC區(qū)神經元集群的鈣活動,;3.對實驗組動物排尿活動相對應的鈣信號進行隨機采樣處理后(shuffled處理),未發(fā)現與排尿活動相對應的鈣活動;PMC區(qū)神經元集群鈣信號的半高寬與小鼠排尿活動的持續(xù)時間,呈線性正相關的關系。(6)藥理學阻斷PMC神經元集群的活動后損傷小鼠的排尿活動先在腹腔注射2 ml生理鹽水,增加小鼠單位時間內自主排尿活動的次數。在4小時實驗過程中,與兩種對照組小鼠(muscimol失效組,n=6只小鼠;PMC注射ACSF組,n=6只小鼠)相比,實驗組小鼠(PMC注射muscimol組,n=9只小鼠)的排尿次數明顯減少(P0.01),排尿的時間間隔和第一次排尿的潛伏期明顯延長(P0.01),總排尿量減少(P0.01),但單次排尿的量顯著增加(P0.01)。部分實驗組小鼠表現為急性充盈性尿失禁,另一部分實驗組小鼠沒有出現排尿活動。(7)PMC神經元集群的鈣活動與小鼠膀胱逼尿肌的收縮功能密切相關在麻醉小鼠(烏拉坦)不同的膀胱灌注速度下,每次膀胱排尿性收縮過程中(尿液排空過程),均會記錄到與之相對應的PMC神經元集群的活動;而儲尿過程中未見明顯PMC神經元集群的鈣信號。在自由活動的小鼠中,每次膀胱排尿性收縮過程中(尿液排空過程),均會記錄到與之相對應的PMC神經元集群的鈣信號;而儲尿過程中未見明顯的PMC神經元集群的活動。相關性分析顯示每次膀胱逼尿肌的收縮與PMC神經元集群的鈣活動密切相關(data,0.51±0.08;shuffled,0.09±0.03;P0.01;n=8只小鼠)。(8)抑制PMC神經元集群的鈣活動損傷小鼠膀胱逼尿肌的收縮功能實驗組(深度氣體麻醉)PMC的神經活動被阻斷后,無法記錄到PMC神經元集群的鈣活動,也不能記錄到膀胱周期性的收縮活動;而對照組(烏拉坦麻醉)PMC的神經活動沒有被阻斷,可以記錄到膀胱周期性的收縮活動(n=4只小鼠/組)。總結上述實驗結果,本研究主要的結論有:大腦、脊髓和外周圍神經構成了支配膀胱逼尿肌的多層次神經網絡結構;整個膀胱逼尿肌接受相同腦區(qū)的神經支配;支配膀胱逼尿肌的腦神經網絡不存在性別差異;位于M1和S1區(qū)第五層的椎體神經元參與支配膀胱逼尿肌;PMC有多個上游腦區(qū),如皮層、PAG和LH等;PMC神經元集群的活動與排尿活動和膀胱逼尿肌的收縮功能密切相關;PMC神經元集群的激活是啟動正常排尿活動和膀胱逼尿肌收縮的最基本條件。
【圖文】：

圖 1-1：PRV-EGFP 成功注射入膀胱壁內 （a）膀胱壁內注射 PRV-EGFP 的示意圖（b）膀胱壁內的神經纖維被 PRV-EGFP 感染（綠色的纖維）。Figure 1-1：PRV-EGFP was injected into into the bladder wall of each adult male mouse successfu(a) Schematic of PRV-EGFP injection into the bladder wall. MPG, major pelvic ganglion. (b) The nerfibers in the bladder wall were infected with PRV-EGFP.接著，我們對脊髓進行了冰凍切片和免疫組化，，并使用共聚焦熒光成像技術對腰骶髓（L6-S1）進行了觀測，發(fā)現在腰骶髓中間外側柱區(qū)域（the intermediolateral area，IML）、 背側灰質后連合（the dorsal gray commissure，DGC）和脊髓背角淺層（tsuperficial dorsal horn，SDH）均有 PRV-EGFP 感染的神經元（見圖 1-2b）；其中位于IML 中的骶髓副交感神經元（the sacral parasympathetic preganglionic neurons，SPN）也感染了 PRV-EGFP，這群神經元發(fā)出的節(jié)后神經纖維可以直接支配膀胱逼尿肌的收縮[2]。我們采用熒光顯微切片斷層成像（fMOST）技術對 L1-L2 以上的脊髓進行了連

節(jié)段被 PRV-EGFP 標記的神經元的分布。（a）L1-L2后連合（DGC）存在 PRV-EGFP 標記的神經元（見圖經元。（b）PRV-EGFP 感染的神經元在 L6-S1 脊髓節(jié)istribution of PRV-EGFP labeled neurons in different se neurons were mainly found in the L1-L2 spinal cord seg neurons were mainly found in the L6-S1 spinal cord se膀胱逼尿肌相關腦內神經元在雄性小鼠大腦中進行了共聚焦顯微成像或 fMOST 成像。我們發(fā)在：腦橋排尿中樞（PMC）、中腦導水管灰質區(qū)（LC）、腦干 A5 細胞群組、下丘腦的內側視前側下丘腦（lateral hypothalamic area，LH）、紅
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R694.5

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本文編號：2693440