發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 12:04

【摘要】：腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC),簡(jiǎn)稱(chēng)腎癌,是泌尿系統(tǒng)位列第二的腫瘤,在成人惡性腫瘤中所占比例約為3%,其中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC),約占全部腎細(xì)胞癌的75%。30%的腎細(xì)胞癌患者在初診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期和發(fā)生轉(zhuǎn)移。進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移的患者五年生存率很差,可能是發(fā)生了轉(zhuǎn)移和耐藥。因此,探討腎臟透明細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)理并尋找有效的治療方法至關(guān)重要。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5)是最新發(fā)現(xiàn)的NLRs(NOD like receptors)家族成員,NLRC5可通過(guò)NF-κB、I型干擾素(IFN-I)及MHC-I基因的表達(dá)來(lái)參加機(jī)體的炎癥和免疫的調(diào)節(jié),尤其是與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。本課題組之前發(fā)現(xiàn)NLRC5在肝癌的組織及細(xì)胞中高表達(dá),通過(guò)正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖,侵襲和遷移。而其在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究中,來(lái)自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,NLRC5在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)高于正常組織,并且NLRC5的表達(dá)量與患者生存預(yù)后和臨床分級(jí)密切相關(guān)。隨后,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了NLRC5對(duì)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移能力的影響,并初步探討其可能作用機(jī)制。方法1.首先從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)分析,分析癌組織和癌旁組織中NLRC5基因(mRNA)差異,并進(jìn)一步探討了NLRC5基因表達(dá)與患者臨床分級(jí)和預(yù)后的相關(guān)性。2.從收集人腎透明細(xì)胞癌組織和癌旁正常腎臟組織,RT-PCR,Western blotting和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)人腎透明細(xì)胞癌組織中NLRC5的表達(dá)變化。同時(shí)利用Western blotting和RT-PCR檢測(cè)人類(lèi)正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2和三種腎癌細(xì)胞株Caki-1、786-O和769-P中NLRC5的表達(dá)水平。3.采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM 2000將過(guò)表達(dá)的pEGFP-C3-NLRC5重組質(zhì)粒和沉默NLRC5的小干擾RNA轉(zhuǎn)入786-O和769-P細(xì)胞系中,RT-PCR和Western blotting檢測(cè)NLRC5的mRNA和蛋白表達(dá)水平。4.采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)及相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行體外細(xì)胞功能分析,同時(shí)觀察NLRC5表達(dá)變化對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。5.將細(xì)胞分為兩組NC細(xì)胞(786-O)和穩(wěn)定低表達(dá)NLRC5細(xì)胞(786-O),將5×10~6/200μl細(xì)胞注射于裸鼠右前肢腋下,每周測(cè)量腫瘤體積,第八周處死裸鼠,剝?nèi)∧[瘤,稱(chēng)量腫瘤重量,并檢測(cè)兩組腫瘤相關(guān)蛋白。結(jié)果1.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果表明,與正常組織相比,癌組織中NLRC5的mRNA水平顯著升高,高表達(dá)NLRC5患者較低表達(dá)患者預(yù)后生存差,并且等級(jí)為T(mén)3-T4的患者NLRC5表達(dá)水平明顯高于T1-T2的患者。2.腎透明細(xì)胞癌組織的NLRC5蛋白和mRNA表達(dá)明顯高于癌旁組織,腫瘤細(xì)胞系中NLRC5蛋白和mRNA水平也高于正常的腎小管上皮細(xì)胞HK-2。3.Western blotting和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瞬時(shí)低表達(dá)或高表達(dá)NLRC5的細(xì)胞系轉(zhuǎn)染成功。4.過(guò)表達(dá)NLRC5能明顯加強(qiáng)786-O和769-P細(xì)胞增殖、侵襲和與移能力,同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、c-Myc和cyclinD 1蛋白水平表達(dá)量顯著升高。沉默NLRCS可明顯抑制786-O和769-P細(xì)胞系增殖、遷移與侵襲能力,同時(shí)也負(fù)向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路。5.低表達(dá)NLRC5組腫瘤的生長(zhǎng)較NC對(duì)照組慢,第八周剝?nèi)〉哪[瘤重量也較NC組輕,Western blotting結(jié)果表明低表達(dá)NLRC5組腫瘤中MMP2,MMP9,PCNA,β-catenin,c-Myc和cyclinD1蛋白比對(duì)照組NC低。結(jié)論NLRC5通過(guò)靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲功能。
【圖文】：

圖1：（A）TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，NLRC5在腎透明細(xì)胞癌腫瘤組織與癌旁正常腎臟組織中NLR表達(dá)情況；（B）NLRC5基因表達(dá)量與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者生存之間的關(guān)系（以均數(shù)為標(biāo)將表達(dá)量分為高低兩組）；（C）NLRC5表達(dá)量與腎透明細(xì)胞癌患者臨床分級(jí)關(guān)系。Fig. 1 (A) Box and whisker plots for NLRC5 gene expression in ccRCC tissues comparednormal kidney tissues from TCGA. (B) Kaplan-Meier survival plot represents overall survivaccRCC patients in TCGA for ccRCC patients categorized according to NLRC5 gene express(high vs low in comparison to the mean expression). (C) T stages analysis based on TCGA databshowed that ccRCC tissues stained with higher level of NLRC5 were associated with higher stprognosis. The T3-T4 vs. the T1-T2. *P< 0.05, **P<0.01, *** P<0.001.4.2 NLRC5在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌組織中以及透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞系中表達(dá)升高收集臨床樣本，，Western blotting和RT-PCR結(jié)果均表明癌組織中NLRC5表達(dá)

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文疫組化染色實(shí)驗(yàn)（圖 3A），HE染色中，癌旁組織腎臟結(jié)構(gòu)較正常，癌組織中腎臟結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生病變，免疫組化結(jié)果中，癌旁組織幾乎不表達(dá)NLRC5，而癌組織中有明顯褐色，證明NLRC5高表達(dá)。HK-2細(xì)胞為正常腎小管上皮細(xì)胞，Caki-1，786-O,和769-P為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞系，癌細(xì)胞系中NLRC5蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯高于正常細(xì)胞HK-2（圖 3B和C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果表明NLRC5可能在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2693127