【摘要】：目的:西格列汀(Sitagliptin,Sita)是二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑,在2型糖尿病患者中可通過抑制胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的降解而改善血糖控制。有文獻(xiàn)報(bào)道,西格列汀能抑制乳腺癌的發(fā)生及上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化,對(duì)結(jié)腸癌也具有抑制作用,但是,目前還沒有西格列汀對(duì)膀胱癌影響的相關(guān)報(bào)道。本研究采用不同濃度的西格列汀處理人膀胱癌細(xì)胞T24與5637,檢測細(xì)胞生存力的變化;明確在西格列汀影響膀胱癌增殖的過程中,Hippo通路的作用;解釋在西格列汀抑制膀胱癌細(xì)胞增殖過程中組織蛋白酶B(CTSB)的變化,以及組織蛋白酶B的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。研究方法:1.體外培養(yǎng)T24與5637細(xì)胞,T24細(xì)胞給與0、0.3m M、0.6m M、1.2m M的西格列汀,5637給與0、0.5m M、1.0m M、1.5m M的西格列汀,分別處理24h、48h、72h,MTS以及平板克隆檢測細(xì)胞活力。2.Western blot檢測西格列汀處理后Hippo通路關(guān)鍵蛋白以及組織蛋白酶B的變化,包括p-LATS909、p-YAP127、CTSB。3.免疫熒光對(duì)比西格列汀處理后YAP的核定位變化。4.RT-PCR檢測西格列汀處理后YAP下游靶基因變化以及CTSB的m RNA變化。5.使用YAP抑制劑verteporfin或者si RNA降低膀胱癌細(xì)胞YAP的活性后,檢測CTSB的m RNA以及蛋白水平變化。6.敲低細(xì)胞CTSB表達(dá)后,CCK8檢測細(xì)胞增殖活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1.給與不同濃度西格列汀處理T24與5637后,與對(duì)照組相比,處理組降低了細(xì)胞活力,且與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.西格列汀處理T24與5637后,分別在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞,western blot發(fā)現(xiàn)p-LATS909一過性增高,p-YAP127持續(xù)增高。給與不同濃度西格列汀處理后,p-YAP127蛋白也增加,而組織蛋白酶B的蛋白表達(dá)降低。3.西格列汀處理T24與5637后,免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,處理組YAP核定位減少。4.西格列汀處理T24與5637后,RT-PCR結(jié)果顯示YAP下游靶基因表達(dá)減少,CTSB的m RNA表達(dá)也降低。5.抑制YAP活性或者敲低YAP后,CTSB的m RNA與蛋白水平均降低。6.敲低細(xì)胞CTSB表達(dá)后,T24及5637細(xì)胞的增殖活力明顯降低,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)論:1.西格列汀抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖。2.Hippo通路在西格列汀抑制膀胱癌細(xì)胞增殖過程中被激活了。3.西格列汀在抑制膀胱癌細(xì)胞增殖過程中降低了組織蛋白酶B的表達(dá)。4.YAP調(diào)控組織蛋白酶B的m RNA及蛋白表達(dá)。5.組織蛋白酶B的表達(dá)降低,增加了細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

圖 3.1 西格列汀抑制膀胱癌細(xì)胞增殖A：不同濃度的西格列汀處理 T24、5637 膀胱癌細(xì)胞系不同時(shí)間后，MTS 檢測細(xì)胞增殖率，B：使用西格列汀處理 T24、5637 膀胱癌細(xì)胞系后細(xì)胞克隆數(shù)。3.2 西格列汀激活 Hippo 通路為了驗(yàn)證西格列汀抑制膀胱癌細(xì)胞增殖過程中 Hippo 通路活性的改變，我們用western blot 檢測了 Hippo 通路的相關(guān)蛋白表達(dá)。我們用 1.2mM 的西格列汀處理 T24細(xì)胞 10min、30min、1h、4h、6h、8h、12h，用 1.5mM 的西格列汀處理 5637 細(xì)胞10min、30min、1h、4h、6h，然后檢測了 p-LATS909、p-YAP127，發(fā)現(xiàn) T24 細(xì)胞中 p-LATS909 在 10min 時(shí)升高，5637 細(xì)胞中 p-LATS909 在 1h 時(shí)升高，p-YAP127在T24和5637中均隨著西格列汀處理時(shí)間延長而升高（圖3.2A）。隨后我們用0mM、0.3mM、0.6mM、1.2mM 四個(gè)濃度的西格列汀處理 T24 細(xì)胞 12h，用 0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM 四個(gè)濃度的西格列汀處理 5637 細(xì)胞 6h，發(fā)現(xiàn) p-YAP127 隨著濃度升高而升高（圖 3.2B）。隨后，我們希望通過免疫熒光驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi) YAP 的定位，

10min、30min、1h、4h、6h，然后檢測了 p-LATS909、p-YAP127，發(fā)現(xiàn) T24 細(xì)胞中 p-LATS909 在 10min 時(shí)升高，5637 細(xì)胞中 p-LATS909 在 1h 時(shí)升高，p-YAP127在T24和5637中均隨著西格列汀處理時(shí)間延長而升高（圖3.2A）。隨后我們用0mM、0.3mM、0.6mM、1.2mM 四個(gè)濃度的西格列汀處理 T24 細(xì)胞 12h，，用 0mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM 四個(gè)濃度的西格列汀處理 5637 細(xì)胞 6h，發(fā)現(xiàn) p-YAP127 隨著濃度升高而升高（圖 3.2B）。隨后，我們希望通過免疫熒光驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi) YAP 的定位，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，用西格列汀處理后，T24、5637 細(xì)胞中 YAP 的核定位明顯減少，與之前 p-YAP127 升高結(jié)果一致（圖 3.2E）。隨后我們對(duì) YAP 下游靶基因進(jìn)行了
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2689540