【摘要】：第一部分 下調(diào)的miR-9通過(guò)靶向調(diào)控STK3介導(dǎo)的MAPKs信號(hào)通路抑制人腎小球系膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡背景和目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以自身免疫耐受遭到破壞、產(chǎn)生自身抗體并介導(dǎo)免疫損傷為特征的自身免疫性疾病,能夠?qū)е露嘀仄鞴俚膿p傷。狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)是SLE所有并發(fā)癥中發(fā)病率和死亡率最高的一種。LN的主要病理特征表現(xiàn)為因系膜細(xì)胞紊亂導(dǎo)致的腎小球腎炎和腎小管間質(zhì)的病變。而系膜細(xì)胞的過(guò)度增殖是LN最原始的病理改變之一。miR-9在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),又在某些腫瘤中表達(dá)上調(diào)。miR-9能夠調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,以及白血病和神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育,但LN的發(fā)病過(guò)程中,miR-9在腎小球中的表達(dá)及其對(duì)系膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響和相應(yīng)機(jī)制還未十分明確。前人研究表明,Toll樣受體4(TLR4)在激活炎癥反應(yīng)過(guò)程中miR-9表達(dá)上調(diào)。而TLR4也能活化人腎小球系膜細(xì)胞(Human mesangial cells,HMCs)中的MAPKs通路促進(jìn)HMCs增殖,造成腎小球損傷。因此,推測(cè)miR-9參與LN過(guò)程中HMCs過(guò)度增殖造成的腎損傷。此外,通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(STK3)是miR-9的靶基因。STK3屬于MAPK相關(guān)激酶家族成員,參與多種細(xì)胞生存和凋亡的調(diào)控。由此,本研究旨在檢測(cè)miR-9和STK3在LN患者腎組織和血液中的表達(dá)及相互關(guān)系,并探討miR-9對(duì)HMCs細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。方法1、本研究納入20對(duì)LN患者的腎組織和同期腎臟腫瘤的癌旁組織,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)腎組織中miR-9和STK3的表達(dá)。通過(guò)western blot方法檢測(cè)STK3的表達(dá)。2、同時(shí)抽取20對(duì)LN患者和健康對(duì)照人群的血液。qRT-PCR法評(píng)估血液中miR-9和STK3的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中STK3的水平。3、設(shè)計(jì)STK3的3' UTR序列的引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增回收DNA產(chǎn)物,酶切,連接和轉(zhuǎn)化,構(gòu)建psiCHECK-2-STK3 WT質(zhì)粒。隨后設(shè)計(jì)STK3的3' UTR序列突變的引物,以psiCHECK-2-STK3WT質(zhì)粒為模板,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、凝膠回收DNA產(chǎn)物、酶切、連接和轉(zhuǎn)化,構(gòu)建psiCHECK-2-STK3MT質(zhì)粒。4、將 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染入 HMCs 細(xì)胞中,qRT-PCR驗(yàn)證miR-9的情況。qRT-PCR和western blot檢測(cè)STK3的表達(dá)。最后將 psiCHECK-2-STK3 WT 和 psiCHECK-2-STK3 MT 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入 miR-9 mimics或miR-9 mimics NC的293T細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察miR-9是否對(duì)STK3有調(diào)控作用。5、將 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 轉(zhuǎn)染到 HMCs 后,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。6、采用 qRT-PCR 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-9 inhibitor 和 miR-9 inhibitor NC 的過(guò)度增殖模型的HMCs中p38、ERK和JNK的表達(dá),并通過(guò)western blot方法明確各組細(xì)胞中p38、ERK和JNK的磷酸化水平。結(jié)果1、LN患者的腎組織中miR-9的表達(dá)顯著高于對(duì)照組織(p0.05)。與對(duì)照組腎癌旁組織相比,STK3在LN患者腎組織中的mRNA水平和蛋白水平均顯著減少(p0.05)。2、與健康對(duì)照組的血液樣本相比,LN患者的血液中miR-9的表達(dá)明顯升高(p0.001),而STK3的mRNA和蛋白水平卻顯著下降(p0.001)。3、擴(kuò)增后在瓊脂糖凝膠電泳的658 bp位置附近出現(xiàn)STK3基因3' UTR序列的條帶。酶切鑒定的結(jié)果可見一條658 bp的目的基因條帶和載體條帶,表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-STK3 WT構(gòu)建成功。隨后以野生型STK3基因3' UTR位點(diǎn)DNA為模板,將野生型STK3的3' UTR區(qū)域728-735位點(diǎn)突變掉,經(jīng)上海生工測(cè)序,結(jié)果正確,表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-STK3MT構(gòu)建成功。4、在HMCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor后,miR-9的表達(dá)較NC組降低4.08倍(p0.001),表明miR-9已在細(xì)胞中成功干擾。干擾miR-9后,STK3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均比NC組明顯升高(p0.001),提示miR-9對(duì)STK3可能存在直接或間接的調(diào)控作用。進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-9 mimics組psiCHECK-2-STK3 WT報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性較NC組顯著降低(p0.01),而STK3 3'UTR序列突變后能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。5、miR-9抑制表達(dá)之后,HMCs的增殖能力較對(duì)照組明顯下降,在24h時(shí)即與inhibitor NC組形成顯著性差異(p0.05),并隨著時(shí)間推移,在48 h和72 h時(shí)抑制程度更加明顯(p0.01)。與此同時(shí),miR-9 inhibitor組凋亡的細(xì)胞數(shù)量是inhibitor NC 組的 3.5 倍(p0.001)。6、與 inhibitor NC 組相比,miR-9 inhibitor 組細(xì)胞中 p38 和 JNK 的 mRNA水平明顯增加(p0.001),ERK的整體mRNA水平顯著降低(p0.05)。miR-9 inhibitor組細(xì)胞p38和JNK的相對(duì)磷酸化水平較inhibitor NC組顯著增加,而ERK的磷酸化水平卻顯著降低(p0.001)。結(jié)論1、miR-9在LN患者腎組織中表達(dá)上調(diào),而LN患者腎組織中STK3在mRNA水平和蛋白水平均下調(diào)。2、miR-9在LN患者血液樣本中表達(dá)上調(diào),而LN患者血液樣本中STK3在mRNA水平和蛋白水平均下調(diào)。3、增加miR-9的表達(dá)能下調(diào)STK3水平,miR-9能通過(guò)與STK3的3' UTR位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控STK3的表達(dá)。4、抑制miR-9的表達(dá)能通過(guò)上調(diào)STK3來(lái)抑制HMCs細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。5、抑制miR-9而上調(diào)的STK3能通過(guò)抑制ERK MAPK通路,活化p38和JNK MAPK通路來(lái)誘導(dǎo)HMCs的抑制增殖和促凋亡效應(yīng)。綜上所述,本研究明確了腎小球系膜細(xì)胞中miR-9對(duì)STK3的調(diào)控作用及其對(duì)系膜細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響,并初步揭示了其促增殖和抑制凋亡的機(jī)制。因此,miR-9水平升高可以作為評(píng)估LN的參考指標(biāo),降低miR-9的水平有望成為L(zhǎng)N基因治療的潛在手段。第二部分miR-125b下調(diào)的STAT3通過(guò)ERK和p38 MAPK信號(hào)通路抑制人腎系膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡背景和目的當(dāng)前LN的治療方法主要為糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑類藥物。但該藥物并非對(duì)所有患者均有效,且會(huì)產(chǎn)生短期或長(zhǎng)期的毒副作用。尋找相關(guān)miRNA將有助于研發(fā)更為有效的治療手段。多項(xiàng)研究表明,miR-125b在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá),并與癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。miR-125b也是免疫系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中的重要參與者,既能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化,又能激活免疫細(xì)胞。miR-125b在SLE患者T淋巴細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),并能直接上調(diào)Kruppel樣因子13(KLF13)、ETS1和STAT3的表達(dá),誘發(fā)炎癥反應(yīng),并與LN的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。但miR-125b在LN患者腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)系膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響和相關(guān)機(jī)制還未十分明確。本研究旨在檢測(cè)miR-125b和STAT3在LN患者腎組織和血液中的表達(dá)、二者是否存在靶向關(guān)系,并探討miR-125b對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。方法1、本研究募集20例LN患者的腎組織和20例同期腎臟腫瘤的癌旁組織,qRT-PCR方法檢測(cè)腎組織中miR-125b和STAT3的表達(dá)。通過(guò)western blot方法檢測(cè)STAT3的表達(dá)。2、同時(shí)采集20例LN患者和20例健康對(duì)照人群的血液。qRT-PCR法觀察血液中miR-125b和STAT3的表達(dá),ELISA檢測(cè)血清中STAT3的蛋白水平。3、設(shè)計(jì)STAT3的3' UTR序列的引物,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增并回收DNA產(chǎn)物、雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)構(gòu)建psiCHECK-2-STAT3 WT質(zhì)粒。隨后設(shè)計(jì)突變的STAT3的3' UTR序列的引物,以psiCHECK-2-STAT3 WT質(zhì)粒為模板,經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、凝膠回收、雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建psiCHECK-2-STAT3MT質(zhì)粒。4、將miR-125b mimics和mimics NC分別轉(zhuǎn)染入HMCs或293T細(xì)胞中,qRT-PCR驗(yàn)證miR-125b的情況。通過(guò)qRT-PCR和western blot明確過(guò)表達(dá)miR-125b 后 STAT3 的表達(dá)。最后將 psiCHECK-2-STAT3 WT 和psiCHECK-2-STAT3 MT 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入 miR-125b mimics 或 miR-125b mimics NC的293T細(xì)胞中。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)觀察miR-125b是否對(duì)STAT3有調(diào)控作用。5、在HMCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b mimics和mimics NC后,細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。6、通過(guò) qRT-PCR 方法比較轉(zhuǎn)染 miR-125b mimics 和 mimics NC 的 HMCs 中p38、ERK和JNK mRNA表達(dá)的變化,并通過(guò)western blot方法了解各組細(xì)胞中p38、ERK和JNK的磷酸化水平。結(jié)果1、與對(duì)照組腎癌旁組織相比,LN患者的腎組織中miR-125b的表達(dá)明顯降低(p0.01),STAT3在LN患者腎組織中的mRNA水平和蛋白水平均顯著升高(p0.05)。2、LN各患者的血液中miR-125b的表達(dá)均較健康對(duì)照組明顯降低(p0.001),而STAT3的mR]NA和蛋白的表達(dá)卻顯著增加(p0.001)。3、PCR擴(kuò)增后在瓊脂糖凝膠電泳的320 bp位置附近出現(xiàn)STAT3基因3' UTR序列的條帶。酶切鑒定的結(jié)果顯示出一條320 bp的目的基因條帶和載體條帶,表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-STAT3 WT構(gòu)建成功。隨后以psiCHECK-2-STAT3 WT的DNA為模板,將野生型STAT3的3' UTR區(qū)域的1438-1445位點(diǎn)突變掉,測(cè)序結(jié)果正確,表明重組質(zhì)粒psiCHECK-2-STAT3 MT構(gòu)建成功。4、miR-125b mimics 組的 miR-125b 的表達(dá)是 NC 組的 3.35 倍(p0.001),表明miR-125b已在293T細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-125b后,STAT3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均較NC組明顯下降(p0.001),提示miR-125b對(duì)STAT3可能存在直接或間接的調(diào)控作用。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,miR-125b mimics組psiCHECK-2-STAT3 WT報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性較NC組顯著降低(p0.001),而STAT3的3' UTR序列突變后能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。5、在HMCs中,過(guò)表達(dá)miR-125b的HMCs細(xì)胞總體增殖能力較NC組明顯降低(p0.01),在48 h時(shí)抑制程度最明顯(p0.001)。與此同時(shí),mimics組凋亡的HMCs細(xì)胞數(shù)量是mimics NC組的3.88倍(p0.001)。6、在HMCs中,與mimicsNC組相比,過(guò)表達(dá)miR-125b的HMCs細(xì)胞中p38mRNA水平明顯增加(p0.001),ERK的整體mRNA水平顯著降低(p0.01),而JNK的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化。同時(shí),過(guò)表達(dá)miR-125b的HMCs細(xì)胞p38的相對(duì)磷酸化水平較mimicsNC組顯著增加(p0.001),而ERK的相對(duì)磷酸化水平顯著降低(p0.01),JNK的相對(duì)磷酸化水平仍未見明顯變化。結(jié)論1、miR-125b在LN患者腎組織中表達(dá)下降,而LN患者腎組織中STAT3在mRNA水平和蛋白水平均顯著上升。2、miR-125b在LN患者血液樣本中表達(dá)減少,而LN患者血液樣本中STAT3在mRNA水平和蛋白水平均明顯增加。3、過(guò)表達(dá)miR-125b能抑制STAT3的表達(dá),miR-125b能通過(guò)與STAT3的3' UTR位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而下調(diào)STAT3的表達(dá)。4、過(guò)表達(dá)miR-125b能通過(guò)下調(diào)STAT3來(lái)抑制HMCs細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。5、過(guò)表達(dá)miR-125b下調(diào)的STAT3能通過(guò)抑制ERK MAPK通路,活化p38 MAPK通路來(lái)誘導(dǎo)HMCs的抑制增殖和促凋亡效應(yīng)。綜上所述,本研究探明了腎小球系膜細(xì)胞中miR-125b通過(guò)靶向下調(diào)STAT3的表達(dá)來(lái)抑制系膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡,初步揭示了 miR-125b抑制增殖和促進(jìn)凋亡的機(jī)制。因此,miR-125b水平可以作為L(zhǎng)N的參考監(jiān)測(cè)指標(biāo),miR-125b是LN基因治療的潛在靶標(biāo)。
【圖文】：

圖１－１邋ｍｉＲ－９和ＳＴＫ３在組織樣本中的表達(dá)逡逑Ａ：邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)ｍｉＲ－９在腎小球組織中的表達(dá)。選擇Ｕ６作為內(nèi)參對(duì)照。與逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)ＳＴＫ３在腎小球組織中的表達(dá)。選擇Ｕ６作為內(nèi)參對(duì)照。與逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｃ、Ｄ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＳＴＫ３在腎小球組織中的表達(dá)。ＧＡＤＰＨ作為內(nèi)參對(duì)逡逑照，數(shù)據(jù)以平均值±５口表示。與ｎｏｒｍａ丨相比，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑以上均實(shí)驗(yàn)重復(fù)３次。逡逑

逑ｚ邋／逡逑圖１－１邋ｍｉＲ－９和ＳＴＫ３在組織樣本中的表達(dá)逡逑Ａ：邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)ｍｉＲ－９在腎小球組織中的表達(dá)。選擇Ｕ６作為內(nèi)參對(duì)照。與逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｂ：邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)ＳＴＫ３在腎小球組織中的表達(dá)。選擇Ｕ６作為內(nèi)參對(duì)照。與逡逑ｎｏｒｍａｌ邋相比，＊＊／？＜０．０１。逡逑Ｃ、Ｄ：邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＳＴＫ３在腎小球組織中的表達(dá)。ＧＡＤＰＨ作為內(nèi)參對(duì)逡逑照，，數(shù)據(jù)以平均值±５口表示。與ｎｏｒｍａ丨相比，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑以上均實(shí)驗(yàn)重復(fù)３次。逡逑５１逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.242

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本文編號(hào)：2688296