【摘要】：精子發(fā)生需要陰囊的溫度低于體溫,研究表明陰囊溫度升高將導(dǎo)致雄性生育力降低甚至不育。既往研究表明睪丸溫度升高會誘發(fā)熱應(yīng)激反應(yīng),并最終導(dǎo)致精子發(fā)生障礙,而目前熱應(yīng)激導(dǎo)致的生精異常的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制以及如何改善熱應(yīng)激引起的睪丸損傷并不十分明確。熱應(yīng)激反應(yīng)往往伴隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生,而褪黑素作為神經(jīng)內(nèi)分泌激素,其本身以及代謝產(chǎn)物具有較好的抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡的作用。但是目前尚未有褪黑素對雄性生殖細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用和機(jī)制的研究。鑒于此,本研究將從以下三方面系統(tǒng)闡述褪黑素在改善熱應(yīng)激導(dǎo)致的精子發(fā)生障礙的可能機(jī)制:1.鑒定褪黑素對熱應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠睪丸精子發(fā)生異常的改善作用;2.解析褪黑素對小鼠精母細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)理;3.探討褪黑素對人精子熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。第一部分褪黑素對熱應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠睪丸精子發(fā)生障礙的保護(hù)作用目的:探討熱應(yīng)激對小鼠睪丸精子發(fā)生和附睪中精子質(zhì)量的影響,以及褪黑素對小鼠睪丸和附睪熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法:將小鼠分為四組:對照組(Con)、褪黑素組(Mel)、熱應(yīng)激組(HS)、熱應(yīng)激+褪黑素組(HS+Mel)。通過腹腔注射給予小鼠褪黑素,并通過將小鼠睪丸置于42°C的水浴30min建立熱應(yīng)激模型。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析小鼠附睪精子氧化應(yīng)激參數(shù)的差異,SCD法檢測附睪精子DNA碎片率。通過ELISA檢測小鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激水平,分別采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測小鼠睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和凋亡相關(guān)分子的m RNA和蛋白水平的表達(dá),并通過小鼠睪丸組織HE染色和TUNEL染色檢測小鼠曲精小管生殖細(xì)胞的生精及凋亡狀況。結(jié)果:HS組與Con組相比,小鼠附睪精子的活力和活率降低,精子的氧化應(yīng)激損傷增加,精子DNA碎片率增加;小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平增加;睪丸組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78、p-e IF2α、CHOP的表達(dá)增加;睪丸組織凋亡相關(guān)分子Caspase3的表達(dá)增加,Bcl-2/Bax的比值降低;睪丸組織曲精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞丟失和凋亡,而腹腔注射褪黑素,可以部分緩解熱應(yīng)激對小鼠附睪和睪丸造成的上述損傷。結(jié)論:褪黑素緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠睪丸精子發(fā)生障礙,降低小鼠睪丸細(xì)胞的氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡;降低附睪中精子的氧化應(yīng)激和DNA碎片率,提高精子質(zhì)量。第二部分褪黑素對熱應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠精母細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制目的:探討褪黑素對小鼠精母細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)理。方法:通過BSA梯度法分離出各組小鼠睪丸組織的粗線期精母細(xì)胞。在GC-2細(xì)胞系中通過在培養(yǎng)液中加入H2O2誘導(dǎo)GC-2細(xì)胞氧化應(yīng)激,通過加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑/抑制劑(衣霉素/4-PBA)誘導(dǎo)/抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生,并采用CHOP si RNA敲除GC-2細(xì)胞系內(nèi)源性CHOP的表達(dá)。通過免疫熒光、ELISA、RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測氧化應(yīng)激、ER stress和凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。通過染色體微鋪展技術(shù)和免疫熒光檢測精母細(xì)胞以及GC-2細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂(double-stand break,DSB)修復(fù)情況。結(jié)果:1.在分離的小鼠粗線期精母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),HS組較Con組的細(xì)胞的4-HNE含量增加;精母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)分子在m RNA和蛋白水平表達(dá)量增加。而HS+Mel組較H組精母細(xì)胞的4-HNE的含量降低,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)的分子的m RNA和蛋白水平上的表達(dá)降低。另外通過免疫熒光顯示脂類氧化產(chǎn)物4-HNE與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)重要蛋白CHOP,以及CHOP和凋亡蛋白c-Caspase3在熱應(yīng)激后的精母細(xì)胞中呈現(xiàn)共定位表達(dá)。在GC-2細(xì)胞系中,加入H2O2和褪黑素發(fā)現(xiàn)褪黑素可以緩解雙氧水導(dǎo)致的CHOP和Caspase3的表達(dá)上調(diào)。2.通過染色體微鋪展技術(shù)發(fā)現(xiàn)HS組的DSB標(biāo)記物γ-H2AX的位點(diǎn)數(shù)顯著高于Con組,HS+Mel組的位點(diǎn)數(shù)較HS組明顯降低。在GC-2細(xì)胞系中,加入衣霉素后CHOP表達(dá)量升高,DNA損傷修復(fù)蛋白Rad51表達(dá)量降低。并且在同時(shí)加入衣霉素和4-PBA后發(fā)現(xiàn),4-PBA抑制衣霉素引起的Rad51的表達(dá)降低。另外,通過免疫熒光檢測X線照射后GC-2細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的DSB修復(fù)情況,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑衣霉素抑制GC-2細(xì)胞的DSB修復(fù)。3.同樣在GC-2細(xì)胞系中加入ER stress誘導(dǎo)劑衣霉素可以增加CHOP和Caspase3的表達(dá),然而通過CHOP si RNA敲除GC-2細(xì)胞系內(nèi)源性CHOP后,加入衣霉素后Caspase3的表達(dá)明顯低于未敲除組加入衣霉素后的表達(dá)。結(jié)論:褪黑素降低熱應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠精母細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)精母細(xì)胞的DSB修復(fù),減少精母細(xì)胞的凋亡。第三部分褪黑素對熱應(yīng)激導(dǎo)致的人精子損傷的保護(hù)機(jī)制目的:探討褪黑素能否改善熱應(yīng)激對人精子的損傷以及其作用機(jī)制。方法:將收集的人精液樣本分為四組:對照組(Con)、褪黑素組(Mel)、熱應(yīng)激組(HS)、熱應(yīng)激+褪黑素組(HS+Mel),向Mel組和HS+Mel組加入1m M的褪黑素37°C孵育30 min,后將H組和H+M組置于42°C培養(yǎng)箱熱處理3h,后轉(zhuǎn)移至37°C培養(yǎng)箱。24h后,檢測各組樣本之間精子活力和活率的差異,以及用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組樣本精子氧化應(yīng)激和凋亡指標(biāo)的差異,用免疫熒光和SCD法檢測各組間精子DNA氧化損傷和碎片率的差異。結(jié)果:HS組較Con組相比精子活力和活率下降,精子線粒體ROS增加,精子線粒體膜電位丟失,精子脂類氧化產(chǎn)物4-HNE產(chǎn)量增加,精子DNA氧化損傷和碎片率增加,精子凋亡率增加,而HS+Mel組與HS組相比精子活力和活率升高,精子線粒體氧化應(yīng)激降低,精子線粒體膜電位丟失減弱,精子脂類氧化產(chǎn)物4-HNE產(chǎn)量降低,精子DNA氧化損傷和碎片率降低,精子凋亡率降低。結(jié)論:褪黑素作有效緩解熱應(yīng)激對人精子造成的氧化應(yīng)激損傷,提高精子質(zhì)量。
【圖文】：

圖 1.1 小鼠熱應(yīng)激處理以及腹腔注射褪黑素的模式圖1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑PCR 引物 TAKARA 中國去離子水 Hyclone 美國Triton X-100 上海生工生物工程公司 中國胎牛血清 (BSA) Sigma 美國反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TAKARA 日本多聚甲醛 聯(lián)發(fā) 天津β-巰基乙醇 Sigma 美國CHOP 一抗 CST 美國GRP78 一抗 SCBT 美國p-eif2α一抗 CST 美國c-Caspase3 一抗 CST 美國

圖 1.2 褪黑素降低熱應(yīng)激后小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平A:各組睪丸組織 MDA 水平，B:各組睪丸組織 4-HNE 水平，C:各組睪丸組織 GSH/GSSH 水平，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3,**P<0.01，***P<0.001。1.3.3 褪黑素降低熱應(yīng)激引起的小鼠睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最近有些研究表明在小鼠睪丸中，熱暴露是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的潛在誘導(dǎo)因素，通過激活未折疊蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡28。為了研究褪黑素對熱應(yīng)激后小鼠睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用，，本實(shí)驗(yàn)從 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測了各組小鼠睪丸細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。GRP78 是重要的 ER 分子伴侶蛋白，其不僅可以作為 ER stress 的傳感器也是 ER stress 的重要調(diào)控者，同時(shí)還參與調(diào)控 UPR信號通路，結(jié)果顯示 HS 組較 Con 組小鼠睪丸組織的 GRP78 的 mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)增高（圖 1.3，A、C、D P<0.001，P<0.01），而褪黑素可以降低熱應(yīng)激誘導(dǎo)的睪丸組織 GRP78 的表達(dá)上調(diào)（圖 1.3，A、C、D P<0.01，P<0.05）。CHOP 作為 PERK 通路和 ATF6 通路上的下游蛋白，還可以介導(dǎo) ER stress 引起的細(xì)胞凋亡通路的激活，同樣在 HS 組的睪丸組織中具有較高水平的表達(dá)（圖
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R698.2

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