【摘要】：精子發(fā)生需要陰囊的溫度低于體溫,研究表明陰囊溫度升高將導致雄性生育力降低甚至不育。既往研究表明睪丸溫度升高會誘發(fā)熱應激反應,并最終導致精子發(fā)生障礙,而目前熱應激導致的生精異常的詳細調控機制以及如何改善熱應激引起的睪丸損傷并不十分明確。熱應激反應往往伴隨著氧化應激的發(fā)生,而褪黑素作為神經內分泌激素,其本身以及代謝產物具有較好的抗氧化應激和抗細胞凋亡的作用。但是目前尚未有褪黑素對雄性生殖細胞熱應激損傷的保護作用和機制的研究。鑒于此,本研究將從以下三方面系統(tǒng)闡述褪黑素在改善熱應激導致的精子發(fā)生障礙的可能機制:1.鑒定褪黑素對熱應激導致的小鼠睪丸精子發(fā)生異常的改善作用;2.解析褪黑素對小鼠精母細胞熱應激損傷的保護作用的調節(jié)機理;3.探討褪黑素對人精子熱應激損傷的保護作用及機制。第一部分褪黑素對熱應激導致的小鼠睪丸精子發(fā)生障礙的保護作用目的:探討熱應激對小鼠睪丸精子發(fā)生和附睪中精子質量的影響,以及褪黑素對小鼠睪丸和附睪熱應激損傷的保護作用。方法:將小鼠分為四組:對照組(Con)、褪黑素組(Mel)、熱應激組(HS)、熱應激+褪黑素組(HS+Mel)。通過腹腔注射給予小鼠褪黑素,并通過將小鼠睪丸置于42°C的水浴30min建立熱應激模型。采用流式細胞技術分析小鼠附睪精子氧化應激參數(shù)的差異,SCD法檢測附睪精子DNA碎片率。通過ELISA檢測小鼠睪丸組織的氧化應激水平,分別采用RT-PCR和Western Blot技術檢測小鼠睪丸組織內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和凋亡相關分子的m RNA和蛋白水平的表達,并通過小鼠睪丸組織HE染色和TUNEL染色檢測小鼠曲精小管生殖細胞的生精及凋亡狀況。結果:HS組與Con組相比,小鼠附睪精子的活力和活率降低,精子的氧化應激損傷增加,精子DNA碎片率增加;小鼠睪丸組織氧化應激水平增加;睪丸組織的內質網應激相關分子GRP78、p-e IF2α、CHOP的表達增加;睪丸組織凋亡相關分子Caspase3的表達增加,Bcl-2/Bax的比值降低;睪丸組織曲精小管內各級生精細胞丟失和凋亡,而腹腔注射褪黑素,可以部分緩解熱應激對小鼠附睪和睪丸造成的上述損傷。結論:褪黑素緩解熱應激導致的小鼠睪丸精子發(fā)生障礙,降低小鼠睪丸細胞的氧化應激、內質網應激和凋亡;降低附睪中精子的氧化應激和DNA碎片率,提高精子質量。第二部分褪黑素對熱應激導致的小鼠精母細胞損傷的保護機制目的:探討褪黑素對小鼠精母細胞熱應激損傷的保護作用的調節(jié)機理。方法:通過BSA梯度法分離出各組小鼠睪丸組織的粗線期精母細胞。在GC-2細胞系中通過在培養(yǎng)液中加入H2O2誘導GC-2細胞氧化應激,通過加入內質網應激誘導劑/抑制劑(衣霉素/4-PBA)誘導/抑制細胞內質網應激的產生,并采用CHOP si RNA敲除GC-2細胞系內源性CHOP的表達。通過免疫熒光、ELISA、RT-PCR和Western Blot技術檢測氧化應激、ER stress和凋亡相關分子的表達。通過染色體微鋪展技術和免疫熒光檢測精母細胞以及GC-2細胞的DNA雙鏈斷裂(double-stand break,DSB)修復情況。結果:1.在分離的小鼠粗線期精母細胞中發(fā)現(xiàn),HS組較Con組的細胞的4-HNE含量增加;精母細胞內質網應激和凋亡相關分子在m RNA和蛋白水平表達量增加。而HS+Mel組較H組精母細胞的4-HNE的含量降低,內質網應激和凋亡相關的分子的m RNA和蛋白水平上的表達降低。另外通過免疫熒光顯示脂類氧化產物4-HNE與內質網相關重要蛋白CHOP,以及CHOP和凋亡蛋白c-Caspase3在熱應激后的精母細胞中呈現(xiàn)共定位表達。在GC-2細胞系中,加入H2O2和褪黑素發(fā)現(xiàn)褪黑素可以緩解雙氧水導致的CHOP和Caspase3的表達上調。2.通過染色體微鋪展技術發(fā)現(xiàn)HS組的DSB標記物γ-H2AX的位點數(shù)顯著高于Con組,HS+Mel組的位點數(shù)較HS組明顯降低。在GC-2細胞系中,加入衣霉素后CHOP表達量升高,DNA損傷修復蛋白Rad51表達量降低。并且在同時加入衣霉素和4-PBA后發(fā)現(xiàn),4-PBA抑制衣霉素引起的Rad51的表達降低。另外,通過免疫熒光檢測X線照射后GC-2細胞在不同時間點的DSB修復情況,發(fā)現(xiàn)內質網誘導劑衣霉素抑制GC-2細胞的DSB修復。3.同樣在GC-2細胞系中加入ER stress誘導劑衣霉素可以增加CHOP和Caspase3的表達,然而通過CHOP si RNA敲除GC-2細胞系內源性CHOP后,加入衣霉素后Caspase3的表達明顯低于未敲除組加入衣霉素后的表達。結論:褪黑素降低熱應激導致的小鼠精母細胞氧化應激和內質網應激,促進精母細胞的DSB修復,減少精母細胞的凋亡。第三部分褪黑素對熱應激導致的人精子損傷的保護機制目的:探討褪黑素能否改善熱應激對人精子的損傷以及其作用機制。方法:將收集的人精液樣本分為四組:對照組(Con)、褪黑素組(Mel)、熱應激組(HS)、熱應激+褪黑素組(HS+Mel),向Mel組和HS+Mel組加入1m M的褪黑素37°C孵育30 min,后將H組和H+M組置于42°C培養(yǎng)箱熱處理3h,后轉移至37°C培養(yǎng)箱。24h后,檢測各組樣本之間精子活力和活率的差異,以及用流式細胞技術檢測各組樣本精子氧化應激和凋亡指標的差異,用免疫熒光和SCD法檢測各組間精子DNA氧化損傷和碎片率的差異。結果:HS組較Con組相比精子活力和活率下降,精子線粒體ROS增加,精子線粒體膜電位丟失,精子脂類氧化產物4-HNE產量增加,精子DNA氧化損傷和碎片率增加,精子凋亡率增加,而HS+Mel組與HS組相比精子活力和活率升高,精子線粒體氧化應激降低,精子線粒體膜電位丟失減弱,精子脂類氧化產物4-HNE產量降低,精子DNA氧化損傷和碎片率降低,精子凋亡率降低。結論:褪黑素作有效緩解熱應激對人精子造成的氧化應激損傷,提高精子質量。
【圖文】：

圖 1.1 小鼠熱應激處理以及腹腔注射褪黑素的模式圖1.2.2 主要實驗試劑PCR 引物 TAKARA 中國去離子水 Hyclone 美國Triton X-100 上海生工生物工程公司 中國胎牛血清 (BSA) Sigma 美國反轉錄試劑盒 TAKARA 日本多聚甲醛 聯(lián)發(fā) 天津β-巰基乙醇 Sigma 美國CHOP 一抗 CST 美國GRP78 一抗 SCBT 美國p-eif2α一抗 CST 美國c-Caspase3 一抗 CST 美國

圖 1.2 褪黑素降低熱應激后小鼠睪丸組織氧化應激水平A:各組睪丸組織 MDA 水平，B:各組睪丸組織 4-HNE 水平，C:各組睪丸組織 GSH/GSSH 水平，數(shù)據表示為均數(shù)±標準差, n=3,**P<0.01，***P<0.001。1.3.3 褪黑素降低熱應激引起的小鼠睪丸組織內質網應激最近有些研究表明在小鼠睪丸中，熱暴露是細胞內質網應激的潛在誘導因素，通過激活未折疊蛋白反應誘導細胞凋亡28。為了研究褪黑素對熱應激后小鼠睪丸內質網應激的保護作用，，本實驗從 mRNA 和蛋白質表達水平檢測了各組小鼠睪丸細胞的內質網應激狀態(tài)。GRP78 是重要的 ER 分子伴侶蛋白，其不僅可以作為 ER stress 的傳感器也是 ER stress 的重要調控者，同時還參與調控 UPR信號通路，結果顯示 HS 組較 Con 組小鼠睪丸組織的 GRP78 的 mRNA 水平和蛋白水平的表達增高（圖 1.3，A、C、D P<0.001，P<0.01），而褪黑素可以降低熱應激誘導的睪丸組織 GRP78 的表達上調（圖 1.3，A、C、D P<0.01，P<0.05）。CHOP 作為 PERK 通路和 ATF6 通路上的下游蛋白，還可以介導 ER stress 引起的細胞凋亡通路的激活，同樣在 HS 組的睪丸組織中具有較高水平的表達（圖
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R698.2

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