【摘要】：目的:探索缺氧損傷后中介素IMD(intermedin)對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞rRGECs(rat renal glomerular endothelial cells)血管生成的影響及機(jī)制。方法:1.常規(guī)情況下培養(yǎng)、傳代rRGECs;2.將RGECs隨機(jī)分為2組:Ⅰ.正常對(duì)照組(N組):二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2+95%空氣)中培養(yǎng);Ⅱ.缺氧組:三氣培養(yǎng)箱(5%CO2+90%N2+5%O2)中培養(yǎng),缺氧6h~([1,2]);并隨機(jī)分為5組;(1)缺氧組(H組);(2)缺氧+IMD組(M0組):在缺氧組基礎(chǔ)上加入IMD(0.1μmol/L)~([1]);(3)缺氧組+IMD+PD98059組(M1組):制作缺氧+IMD組前培養(yǎng)基中加入胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extemal Signal Regulated Kinase,ERK)酶抑制劑(PD98059,5uM)~([3]);(4)缺氧+IMD組+LY-294002組(M2組):制作缺氧+IMD組前培養(yǎng)基中加入磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3 Kinase,PI3K)酶抑制劑(LY-294002,100uM)~([3]);(5)缺氧+IMD組+L-NAME組(M3組):制作缺氧+IMD組前培養(yǎng)基中加入一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)酶抑制劑(L-NAME,10uM)~([3]);3.用MTT(噻唑藍(lán))比色法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況;4.小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管腔樣結(jié)構(gòu)成環(huán)數(shù)、分支數(shù)、管腔長(zhǎng)度;5.Western blot法檢測(cè)PI3K、AKT、eNOS總蛋白及磷酸化水平;6.Western blotting法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、磷酸化血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(phosphorylation vascular endothelial growth factor receptor 2,p-VEGFR2)蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)rRGECs存活率檢測(cè):與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組吸光度值下降;但I(xiàn)MD組較缺氧組各組吸光度值均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與M0組相比,MI組、M2組吸光度值均降低,p0.05,M3組無明顯變化;與M1組相比,M2組吸光度值無差異,M3組吸光度值升高,p0.05;與M2組相比,M3組吸光度值升高,p0.05。(2)管腔樣結(jié)構(gòu)檢測(cè):正常對(duì)照組、缺氧組、IMD組管腔樣結(jié)構(gòu)成環(huán)數(shù)、分支數(shù)、管腔長(zhǎng)度依時(shí)間梯度12小時(shí)、24小時(shí)和48小逐漸下降,p0.05。隨著時(shí)間延長(zhǎng),內(nèi)皮細(xì)胞間連接逐漸松弛,管腔樣結(jié)構(gòu)逐漸退化,48小時(shí)管腔樣結(jié)構(gòu)基本崩解,三組各指標(biāo)均無差異。24小時(shí)內(nèi),與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組三者均下降,p0.05;與缺氧組相比,IMD組管腔樣結(jié)構(gòu)分支數(shù)、管腔長(zhǎng)度、成環(huán)數(shù)增多,p0.05,IMD組較缺氧組程度輕,p0.05;48h三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯差異;與M0組相比,MI組管腔成環(huán)數(shù)減低,M2組、M3組管腔樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度、分支數(shù)均降低,p0.05;與M1組相比,M2組、M3組管腔成環(huán)數(shù)增高,管腔樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度、分支數(shù)均降低,p0.05;與M2組相比,M3組管腔樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度、分支數(shù)均增高,p0.05。(3)IMD誘導(dǎo)血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化情況:與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組VEGF表達(dá)均增多,p0.05;IMD組:M0組、MI組、M2組、M3組彼此無差異;與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組VE-cadherin表達(dá)均降低,p0.05,但I(xiàn)MD組VE-cadherin表達(dá)較缺氧組增多,IMD組間VE-cadherin表達(dá)無差異;與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組p-VEGFR2表達(dá)均增多,p0.05,與缺氧組相比,M2組p-VEGFR2表達(dá)無差異,M0、MI、M3組p-VEGFR2表達(dá)減少,p0.05,與M0組相比MI、M3組p-VEGFR2表達(dá)無差異,M2組表達(dá)增多,p0.05,與M1組相比,M2組p-VEGFR2表達(dá)增多,p0.05,M3組p-VEGFR2表達(dá)無差異;與M2組相比,M3組p-VEGFR2表達(dá)減少,p0.05;與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組p-ERK1/2表達(dá)減少,p0.05,與缺氧組相比,M0、M2、M3組p-ERK1/2表達(dá)增多,且彼此間無差異,而M1組表達(dá)減少,與M0組相比M1組p-ERK1/2表達(dá)減少,p0.05,M2、M3組p-ERK1/2表達(dá)無差異,與M1組相比M2、M3組p-ERK1/2表達(dá)增多,p0.05,與M2組相比M3組p-ERK1/2表達(dá)無差異;與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組p-PI3K表達(dá)減少,與缺氧組相比,M0、M1、M3組p-PI3K表達(dá)增多,M2組表達(dá)減少,與M0組相比M1、M3組p-PI3K表達(dá)無差異,M2組p-PI3K表達(dá)減少,p0.05;與M1組相比M2組p-PI3K表達(dá)減少,p0.05;M3組表達(dá)無差異,與M2組相比M3組p-PI3K表達(dá)增多,p0.05;與正常對(duì)照組相比,缺氧組、IMD組p-eNOS表達(dá)均減少,與缺氧組相比,p0.05,M0、M1、M2組p-eNOS表達(dá)增多,M3組表達(dá)減少,p0.05,與M0組相比M1組p-eNOS表達(dá)無差異,M2、M3組p-eNOS表達(dá)減少,p0.05,與M1組相比,M2、M3組p-eNOS表達(dá)減少,與M2組相比M3組p-eNOS表達(dá)減少,p0.05。結(jié)論:缺氧可降低rRGECs存活率,IMD在缺氧條件下可作用于ERK、PI3K/AKT通路增加rRGECs存活率,減輕缺氧損傷,而eNOS通路不參與這一過程;缺氧會(huì)刺激rRGECs VEGF產(chǎn)生增多、p-VEGFR2表達(dá)增多,IMD對(duì)VEGF表達(dá)無影響;IMD能夠上調(diào)缺氧rRGECs VE-cadherin表達(dá),降低p-VEGFR2表達(dá);阻斷PI3K通路則p-VEGFR2表達(dá)增多,機(jī)制可能是IMD通過作用于VE-cadherin/VEGFR2/PI3K復(fù)合物,減弱了VEGFR2的磷酸化,從而減弱rRGECs對(duì)VEGF刺激的應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而抑制過度出芽;IMD在誘導(dǎo)缺氧損傷rRGECs管腔擴(kuò)增需激活ERK1/2,但不會(huì)限制血管萌發(fā);IMD作用于PI3K/AKT/eNOS信號(hào)級(jí)聯(lián)促進(jìn)缺氧損傷rRGECs血管的長(zhǎng)度及分支等生長(zhǎng);IMD通過對(duì)VE-cadherin和下游PI3K/AKT/eNOS和ERK1/2通道的調(diào)控,促進(jìn)血管正常化生成。同時(shí)PI3K/AKT是eNOS的上游信號(hào)通路,但并非唯一通路。
【圖文】：

本研究 MTT 實(shí)驗(yàn)顯示：與正常對(duì)照組相比，缺氧組、IMD 組隨時(shí)間延長(zhǎng)吸光度值下降；但 IMD 組較缺氧組各組吸光度值均升高；與 M0 組相比，MI 組、M2組吸光度值均降低，M3 組無明顯變化；與 M1 組相比，M2 組吸光度值無差異，M3 組吸光度值升高；與 M2 組相比，M3 組吸光度值升高。見表 1、柱狀圖 1。表 1 中介素對(duì)缺氧 rRGECs 存活的影響（ x±s, n=3）分組 干預(yù)因素 12h 24h 48hN 組 － －0.68±0.01 0.91±.032 0.91±0.01H 組 H －0.42±0.013a0.54±0.01a0.55±0.01aM0 組 H/R 缺氧+IMD0.65±0.01ab0.81±0.01ab0.82±0.01abM1 組 H/R 缺氧+IMD+PD980590.52±0.01abc0.71±0.01abc0.72±0.01abcM2 組 H/R 缺氧+IMD+LY-2940020.53±0.01abc0.71±0.01abc0.72±0.01abcM3 組 H/R 缺氧+IMD+L-NAME0.63±0.01abde0.80±0.01abde0.80±0.01abde注：與 N 組相比，ap<0.05；與 H 組相比，bp<0.05；與 M0 組相比，cp<0.05；與 M1 組相比，dp<0.05；與 M2 組相比，ep<0.05

柱狀圖 2 管腔長(zhǎng)度（n=3）與 N 組相比，ap<0.05；與 H 組相比，，bp<0.05；與 M0 組相比，cp<0.05；與 M1 組相比，dp<0.05；2 組相比，ep<0.05
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2685681