【摘要】：目的:探討微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用及其相關(guān)的分子機(jī)制,為腎小球疾病的診斷和治療提供新思路。方法:(1)用TGF-β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的條件永生化小鼠足細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為:正常對(duì)照組;24h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理24h);48h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理48h);72h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理72h);4ng/ml TGF-β1處理組(使用4ng/ml TGF-β1處理72h);8 ng/ml TGF-β1處理組(使用8 ng/ml TGF-β1處理72h);12ng/ml TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理72h)。利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6蛋白的表達(dá),RT-q PCR和Western blot法檢測(cè)synaptopodin和CD2AP的表達(dá),RT-q PCR法檢測(cè)miR-155的表達(dá);(2)miR-155過表達(dá)載體及低表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,RT-q PCR法驗(yàn)證miR-155轉(zhuǎn)染效率,ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-6蛋白的表達(dá),RT-q PCR和Western blot法檢測(cè)synaptopodin和CD2AP的表達(dá);(3)12ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞后,在不同時(shí)間點(diǎn)用Western blot法檢測(cè)p38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,erk)MAPK通路的激活情況;使用20μmol/L SB203580和20μmol/L U0126作用足細(xì)胞2h后,RT-q PCR和Western blot法檢測(cè)synaptopodin和CD2AP的表達(dá),RT-q PCR法檢測(cè)miR-155的表達(dá);(4)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-155與可能靶基因雙特異性蛋白磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)7 3’非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)的結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)DUSP7基因活性,轉(zhuǎn)染miR-155表達(dá)載體后RT-q PCR法檢測(cè)DUSP7 m RNA的表達(dá),Western blot法檢測(cè)p38 MAPK通路和erk MAPK通路的激活情況。結(jié)果:(1)與正常對(duì)照相比,4ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞48h后足細(xì)胞增殖活性降低,并且隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)、作用濃度升高而下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);4ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞上清TNF-α、IL-6表達(dá)上升,在12ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)72h后達(dá)到最高值,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);48h TGF-β1處理組、72h TGF-β1處理組、8 ng/ml TGF-β1處理組及12ng/ml TGF-β1處理組中synaptopodin、CD2AP m RNA和蛋白表達(dá)降低,miR-155的表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)與TGF-β1處理組相比,高表達(dá)足細(xì)胞中的miR-155后,TNF-α、IL-6表達(dá)進(jìn)一步升高(P0.01),synapotodin、CD2AP m RNA和蛋白表達(dá)下調(diào),miR-155低表達(dá)則產(chǎn)生相反的作用,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)與正常對(duì)照組相比,12ng/ml TGF-β1激活p38 MAPK通路和erk MAPK通路,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與TGF-β1處理組相比,TGF-β1+SB203580組、TGF-β1+U0126組中synaptopodin、CD2AP的m RNA和蛋白均表達(dá)升高,TGF-β1+U0126組中miR-155的相對(duì)表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(4)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-155與DUSP7 3’UTR區(qū)存在相互作用的結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)示細(xì)胞+pre-miR-155+WT-3’UTR組的熒光信號(hào)比值較空白細(xì)胞組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);過表達(dá)miR-155可明顯降低足細(xì)胞中DUSP7m RNA的相對(duì)表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與TGF-β1處理組相比,TGF-β1+pre-miR-155組中p38及erk MAPK通路磷酸化水平升高,而TGF-β1+miR-155sponge組則降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)MiR-155在TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào),并與TGF-β1作用時(shí)間和劑量呈相關(guān)性;(2)miR-155與足細(xì)胞損傷密切相關(guān),高表達(dá)miR-155促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,低表達(dá)miR-155可逆轉(zhuǎn)這一過程;(3)miR-155可通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路參與TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。
【圖文】：

圖 2-1 足細(xì)胞增殖活力注：與正常對(duì)照組相比較，，#P＜0.01Figure 2- 1 Cell survival rate of podocyteNote: Compared with the normal control group,#P＜0.01上清炎癥因子表達(dá)的影響清液，使用 ELISA 法檢測(cè)上清液中炎癥因子的蛋24 小時(shí)后細(xì)胞上清中 TNF-α、IL-6 等炎癥因子的F-β1 誘導(dǎo)劑量的增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞上清l TGF-β1 誘導(dǎo)足細(xì)胞 72 小時(shí)后達(dá)到最高值。差異

圖 2-3 TGF-β1 誘導(dǎo)足細(xì)胞后 synaptopodin、CD2AP mRNA 的表達(dá)注：與正常對(duì)照組相比較，*P＜0.05，#P＜0.01Figure 2- 3 Expression of synaptopodin and CD2AP mRNA in podocytes induced by TGF-βNote: Compared with the normal control group, *P＜0.05,#P＜0.01F-β1 對(duì)足細(xì)胞 synaptopodin、CD2AP 蛋白表達(dá)的影響用 western blot 法檢測(cè) TGF-β1 誘導(dǎo)的足細(xì)胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋測(cè)結(jié)果示：與正常對(duì)照組相比，24h TGF-β1 處理組、4 ng/ml TGF-β1 topodin、CD2AP 的蛋白無明顯變化，當(dāng) TGF-β1 濃度達(dá)到 8ng/ml，干預(yù)時(shí)時(shí)后足細(xì)胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋白的表達(dá)下降，并呈劑量和時(shí)間依統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這與足細(xì)胞中 synaptopodin、CD2AP mRNA 的
【學(xué)位授予單位】：右江民族醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2685142