發(fā)布時間：2020-05-28 10:58

【摘要】：目的:探討微小RNA-155(microRNA-155,miR-155)在轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導的足細胞損傷中的調控作用及其相關的分子機制,為腎小球疾病的診斷和治療提供新思路。方法:(1)用TGF-β1誘導體外培養(yǎng)的條件永生化小鼠足細胞,將細胞隨機分為:正常對照組;24h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理24h);48h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理48h);72h TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理72h);4ng/ml TGF-β1處理組(使用4ng/ml TGF-β1處理72h);8 ng/ml TGF-β1處理組(使用8 ng/ml TGF-β1處理72h);12ng/ml TGF-β1處理組(使用12ng/ml TGF-β1處理72h)。利用CCK8法檢測細胞增殖活力,ELISA法檢測細胞上清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白細胞介素(interleukin,IL)-6蛋白的表達,RT-q PCR和Western blot法檢測synaptopodin和CD2AP的表達,RT-q PCR法檢測miR-155的表達;(2)miR-155過表達載體及低表達載體轉染后,RT-q PCR法驗證miR-155轉染效率,ELISA法檢測TNF-α和IL-6蛋白的表達,RT-q PCR和Western blot法檢測synaptopodin和CD2AP的表達;(3)12ng/ml TGF-β1誘導足細胞后,在不同時間點用Western blot法檢測p38絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,erk)MAPK通路的激活情況;使用20μmol/L SB203580和20μmol/L U0126作用足細胞2h后,RT-q PCR和Western blot法檢測synaptopodin和CD2AP的表達,RT-q PCR法檢測miR-155的表達;(4)生物信息學分析預測miR-155與可能靶基因雙特異性蛋白磷酸酶(dual specificity phosphatase,DUSP)7 3’非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)的結合位點,雙熒光素酶報告基因檢測DUSP7基因活性,轉染miR-155表達載體后RT-q PCR法檢測DUSP7 m RNA的表達,Western blot法檢測p38 MAPK通路和erk MAPK通路的激活情況。結果:(1)與正常對照相比,4ng/ml TGF-β1誘導足細胞48h后足細胞增殖活性降低,并且隨干預時間延長、作用濃度升高而下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01);4ng/ml TGF-β1誘導足細胞上清TNF-α、IL-6表達上升,在12ng/ml TGF-β1誘導72h后達到最高值,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01);48h TGF-β1處理組、72h TGF-β1處理組、8 ng/ml TGF-β1處理組及12ng/ml TGF-β1處理組中synaptopodin、CD2AP m RNA和蛋白表達降低,miR-155的表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);(2)與TGF-β1處理組相比,高表達足細胞中的miR-155后,TNF-α、IL-6表達進一步升高(P0.01),synapotodin、CD2AP m RNA和蛋白表達下調,miR-155低表達則產生相反的作用,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);(3)與正常對照組相比,12ng/ml TGF-β1激活p38 MAPK通路和erk MAPK通路,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與TGF-β1處理組相比,TGF-β1+SB203580組、TGF-β1+U0126組中synaptopodin、CD2AP的m RNA和蛋白均表達升高,TGF-β1+U0126組中miR-155的相對表達量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);(4)生物信息學分析預測miR-155與DUSP7 3’UTR區(qū)存在相互作用的結合位點,雙熒光素酶報告基因檢測示細胞+pre-miR-155+WT-3’UTR組的熒光信號比值較空白細胞組低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);過表達miR-155可明顯降低足細胞中DUSP7m RNA的相對表達量,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);與TGF-β1處理組相比,TGF-β1+pre-miR-155組中p38及erk MAPK通路磷酸化水平升高,而TGF-β1+miR-155sponge組則降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:(1)MiR-155在TGF-β1誘導的足細胞損傷中表達上調,并與TGF-β1作用時間和劑量呈相關性;(2)miR-155與足細胞損傷密切相關,高表達miR-155促進了TGF-β1誘導的足細胞損傷,低表達miR-155可逆轉這一過程;(3)miR-155可通過調控MAPK信號通路參與TGF-β1誘導的足細胞損傷。
【圖文】：

圖 2-1 足細胞增殖活力注：與正常對照組相比較，，#P＜0.01Figure 2- 1 Cell survival rate of podocyteNote: Compared with the normal control group,#P＜0.01上清炎癥因子表達的影響清液，使用 ELISA 法檢測上清液中炎癥因子的蛋24 小時后細胞上清中 TNF-α、IL-6 等炎癥因子的F-β1 誘導劑量的增加和干預時間的延長，細胞上清l TGF-β1 誘導足細胞 72 小時后達到最高值。差異

圖 2-3 TGF-β1 誘導足細胞后 synaptopodin、CD2AP mRNA 的表達注：與正常對照組相比較，*P＜0.05，#P＜0.01Figure 2- 3 Expression of synaptopodin and CD2AP mRNA in podocytes induced by TGF-βNote: Compared with the normal control group, *P＜0.05,#P＜0.01F-β1 對足細胞 synaptopodin、CD2AP 蛋白表達的影響用 western blot 法檢測 TGF-β1 誘導的足細胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋測結果示：與正常對照組相比，24h TGF-β1 處理組、4 ng/ml TGF-β1 topodin、CD2AP 的蛋白無明顯變化，當 TGF-β1 濃度達到 8ng/ml，干預時時后足細胞中 synaptopodin、CD2AP 蛋白的表達下降，并呈劑量和時間依統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這與足細胞中 synaptopodin、CD2AP mRNA 的
【學位授予單位】：右江民族醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2685142