【摘要】：目的:腎纖維化不僅是慢性腎病的特征性病變,還是導(dǎo)致腎功能急劇衰竭的關(guān)鍵因素,目前尚無有效的治療方法。多項研究表明腎間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生都與TGF-?1/Smad信號通路密切相關(guān)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn):紫花前胡苷(nodakenin)可下調(diào)TGF-?1/Smad信號通路,具有改善腎臟纖維化的作用,但具體機制不清。本實驗擬通過小鼠體內(nèi)和細(xì)胞體外實驗進一步深入研究紫花前胡苷是否通過抑制snail蛋白表達(dá)延緩腎臟纖維化。方法:1.體內(nèi)實驗觀察紫花前胡苷對腎纖維化的作用:取6~8周齡SPF級Balb/c小鼠(雄性)28只,體重17~20 g,隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(unilateral ureteral obstraction,UUO組)、低劑量組(1 mg/kg Noda,L組)、高劑量組(10 mg/kg Noda,H組),每組7只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照常規(guī)方法制作UUO模型,其中Noda組、Sham組、UUO組分別給予紫花前胡苷和等體積10%Tween 80溶劑,連續(xù)灌胃7天后處死小鼠,檢測血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)變化;HE染色觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)改變和炎癥細(xì)胞浸潤;糖原染色(PAS染色)、Masson染色、天狼星紅染色(Sirius Red)觀察腎間質(zhì)基質(zhì)沉積和纖維化的嚴(yán)重程度;免疫組織化學(xué)、Western blot檢測纖維化指標(biāo)蛋白(α-SMA、TGF-?1、Vimentin、Fibronectin蛋白)、TGF-?1/Smad通路相關(guān)蛋白和Snail蛋白。2.體外實驗觀察紫花前胡苷對腎小管纖維化的作用及其機制:1)體外實驗觀察紫花前胡苷對腎小管纖維化的作用:采用大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)置于5%CO_2、37℃和足夠濕度的培養(yǎng)箱中,用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到到80%-90%融合度,采用0.25 g/L胰蛋白酶消化、傳代備用,將細(xì)胞分為對照組(CTL組)、模型組(TGF-β1組)、紫花前胡苷低劑量組、中劑量組和高劑量組(TGF-β1+10μm Noda組、TGF-β1+20μm Noda組、TGF-β1+40μm Noda組),6 ng/μL人重組TGF-β1刺激后給于不同濃度紫花前胡苷(nodakenin,Noda)干預(yù),處理48 h后倒置顯微鏡、免疫熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化;Western blot技術(shù)和實時熒光定量PCR檢測纖維化相關(guān)蛋白、TGF-?1/Smad通路相關(guān)蛋白和Snai1蛋白的表達(dá)。2)慢病毒轉(zhuǎn)染snail觀察對腎小管纖維化的作用:慢病毒轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞過表達(dá)snail蛋白(snail-oe),Western blot驗證轉(zhuǎn)染是否成功;將細(xì)胞分為snail-oe組,snail-oe+TGF-β1組,snail-oe+TGF-β1+Noda組和snail-oe+Noda組,干預(yù)處理48 h后Western blot法檢測相關(guān)纖維化蛋白、TGF-?1/Smad通路的表達(dá)。結(jié)果1、體內(nèi)實驗:1)血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)結(jié)果顯示,與UUO組小鼠相比,高劑量紫花前胡苷組可明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;2)病理染色發(fā)現(xiàn),UUO組小鼠的腎臟發(fā)生嚴(yán)重的腎小管擴張,腎小管上皮細(xì)胞脫落表現(xiàn),擴張的腎小管區(qū)域顯示大量基質(zhì)沉積,出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)纖維化纖維化區(qū)域,H組小鼠與其相比,腎小管擴張、基質(zhì)沉積以及纖維化區(qū)域均出現(xiàn)明顯減少,表明紫花前胡苷可顯著延緩UUO的病理改變。3)Western blot法檢測結(jié)果顯示,與UUO組結(jié)果相比,紫花前胡苷干預(yù)可以明顯降低UUO小鼠纖維化相關(guān)蛋白(α-SMA、TGF-?1、Vimentin和Fbironectin)、TGF-?1/Smad通路和Snail蛋白的過表達(dá);而與UUO組相比,低劑量組(L組)的作用并不明顯。2、體外實驗:1)與CTL組比較,TGF-β1組刺激48 h后,細(xì)胞體積變大,失去極性,E-cadherin的表達(dá)相對變少,而加入紫花前胡苷干預(yù)后可以抑制這種現(xiàn)象;2)qPCR、Western blot結(jié)果顯示,與CTL組相比,TGF-β1組纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高,加入紫花前胡苷干預(yù),尤其是20μm紫花前胡苷可以明顯降低這些蛋白的表達(dá);3)實驗結(jié)果顯示,與CTL組相比,TGF-β1組的TGF-β1/Smad信號通路的各蛋白和Snail蛋白表達(dá)明顯升高,經(jīng)紫花前胡苷干預(yù)可以降低它們在細(xì)胞中的表達(dá);4)紫花前胡苷在snail過表達(dá)后的干預(yù)作用消失,不能有效抑制相關(guān)纖維化蛋白和TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)論:1、紫花前胡苷可延緩腎間質(zhì)纖維化部分恢復(fù)UUO小鼠受損腎功能;2、紫花前胡苷可以降低TGF-β1刺激NRK-52E產(chǎn)生的相關(guān)纖維化蛋白和TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá);3、紫花前胡苷延緩腎間質(zhì)纖維化的作用是依賴Snail蛋白表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2684175