【摘要】：目的:腎臟的纖維化包括腎小球的硬化和腎間質(zhì)的纖維化,是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的共同病理特征。我國(guó)CKD的發(fā)病率為10.8%,CKD最終會(huì)因腎臟的纖維化進(jìn)展為終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)最終需要腎臟替代治療維持生命,給社會(huì)和家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管近二十年來新藥不斷涌現(xiàn),腎臟纖維化的發(fā)生率仍然高居不下。因此,尋找有效的藥物抑制腎臟的纖維化,進(jìn)而抑制ESRD的發(fā)生,將會(huì)極大的提高患者的生活質(zhì)量,并給社會(huì)和家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。微小RNA(microRNAs,miRs)是一種由約22核苷酸組成的短小,單鏈,非編碼RNAs可調(diào)控人體50%基因組最終干預(yù)蛋白的翻譯。近年研究證實(shí)miRs異常表達(dá)參與多種腎臟病所致腎纖維化的發(fā)生機(jī)制。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)miR-150與狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)患者腎病病理的慢性活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)。在體外細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-150在通過下調(diào)其靶蛋白細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(suppressor of cytokine signal 1,SOCS1)來增加促纖維化蛋白合成導(dǎo)致腎臟纖維化發(fā)生。本研究旨在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中探討miR-150抑制劑是否可以通過抑制miR-150的表達(dá),上調(diào)SOCS1從而緩解腎臟的纖維化,并在體外實(shí)驗(yàn)中探討抑制miR-150可抑制腎臟纖維化的新機(jī)制,miR-150抑制劑有望成為治療腎臟纖維化的新靶點(diǎn)。研究方法:選取近1年初發(fā)未治,經(jīng)腎穿刺活檢證實(shí)為L(zhǎng)N患者的腎組織,同時(shí)選取與LN患者性別、年齡匹配的腎腫瘤患者的遠(yuǎn)瘤旁(大于5 cm)組織作為對(duì)照,石蠟切片定位miR-150的表達(dá)位置。冰凍腎組織提取miRs,檢測(cè)腎組織中miR-150的表達(dá)。同時(shí)研究miR-150的表達(dá)與炎性指標(biāo)纖維化指標(biāo)的關(guān)系。然后給與LN小鼠皮下注射FAM標(biāo)記的LNA-anti-miR-150(2mg/kg或4mg/kg)或PBS作對(duì)照。觀察小鼠全身反應(yīng)、6小時(shí)后收集腎組織,制作OCT冰凍組織塊和miRs提取,免疫熒光觀察miR-150抑制劑吸收情況,qPCR定量檢測(cè)miR-150抑制水平。隨后研究miR-150抑制劑在LN引起的腎小球硬化小鼠中的治療效果,自發(fā)狼瘡性腎炎的Fcgr2b基因敲除小鼠給予LNA-anti-miR-150皮下注射處理后8周后(每周兩次),檢測(cè)小鼠的血尿指標(biāo),PAS、MASSON病理染色,促炎因子白介素6(Interleukin-6,Il6),干擾素γ(Interferonγ,Ifnγ),腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,Tnfα)以及促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ1,Tgfβ1),平滑肌肌動(dòng)蛋白(αSmooth muscle activating protein,αSma),纖維連接蛋白(Fibronectin,Fn)的mRNA和蛋白水平。檢測(cè)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。檢測(cè)SOCS1的表達(dá)。同時(shí)研究miR-150抑制劑在葉酸(folic acid,FA)誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化小鼠中的治療效果。CD1小鼠250mg/kg葉酸誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化,并給于LNA-anti-miR-150皮下注射處理后4周后(每周兩次),檢測(cè)小鼠的血尿指標(biāo),病理染色,炎性和纖維化指標(biāo)的變化。最后通過沉默/過表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞(HK2)的miR-150,用巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)24小時(shí),檢測(cè)腎小管損傷指標(biāo),炎性相關(guān)指標(biāo),纖維化相關(guān)指標(biāo),SOCS1相關(guān)通路。結(jié)果:1.LN患者的腎組織中miR-150的表達(dá)較正常腎臟組織升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-150主要位于腎小管上皮細(xì)胞,部分位于足細(xì)胞,少量位于上系膜細(xì)胞。LN患者腎組織中的炎性指標(biāo)和纖維化指標(biāo)表達(dá)均升高。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,FAM標(biāo)示的LNA-anti-miR-150被LN小鼠腎組織廣泛吸收且分布均勻,2mg/kg的miR-150抑制劑有效抑制miR-150腎臟組織的表達(dá)。3.自發(fā)狼瘡性腎炎的Fcgr2b基因敲除小鼠給予LNA-anti-miR-150皮下注射處理后8周后(每周兩次),肝腎功能、體重較Scrambled組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明其安全,無肝腎及系統(tǒng)毒性。與Scrambled組相比,LNA-anti-miR-150抑制劑組的LN小鼠的蛋白尿、雙鏈DNA(double strands DNA,ds-DNA)水平均下降,PAS、MASSON染色提示腎臟纖維化程度緩解。LNA-anti-miR-150使LN小鼠促炎因子IL-6,IFN-γ,TNF-α以及促纖維化因子TGF-β1,α-SMA,FN的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)減少,抗纖維化因子SOCS1的mRNA和蛋白表達(dá)增加。并且LNA-anti-miR-150減少LN小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。4.FA誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化小鼠給予LNA-anti-miR-150處理后4周后(每周兩次),肝腎功能、體重較Scrambled組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明其安全,無肝腎毒性及系統(tǒng)毒性。與對(duì)照組相比,PAS、MASSON染色提示腎臟纖維化程度緩解。并且LNA-anti-miR-150使腎間質(zhì)纖維化小鼠促炎因子Il6,Ifnγ,Tnfα,促纖維化因子I型膠原蛋白(collagen I,Col1),αSma,Fn的mRNA表達(dá)減少,抗纖維化因子Socs1的mRNA表達(dá)增加,使促纖維化蛋白COL-1,αSMA,FN表達(dá)減少,抗纖維化蛋白SOCS1表達(dá)增加。LNA-anti-miR-150能減少腎間質(zhì)纖維化小鼠巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。5.HK2細(xì)胞過表達(dá)miR-150,予以巨噬細(xì)胞上清液刺激后,HK2細(xì)胞損傷嚴(yán)重且發(fā)生明顯纖維化,SOCS1的表達(dá)下調(diào),且兩面神經(jīng)酶(Janus Kinase,JAK)—信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)通路相關(guān)指標(biāo)p-JAK1,p-JAK2,p-STAT1,p-STAT3的表達(dá)明顯增高;HK2細(xì)胞沉默miR-150,予以巨噬細(xì)胞上清液刺激后,SOCS1的表達(dá)升高且JAK—STAT通路相關(guān)指標(biāo)p-JAK1,p-STAT1的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:1.miR-150在LN腎活檢組織中處于高表達(dá)狀態(tài)且主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞,足細(xì)胞,系膜細(xì)胞上,miR-150的表達(dá)與炎癥纖維化有關(guān);2.抑制miR-150有效減輕LN引起腎小球硬化;3.抑制miR-150有效緩解腎間質(zhì)纖維化;4.miR-150抑制劑通過調(diào)節(jié)SOCS1-JAK-STAT通路緩解腎臟纖維化;5.miR-150抑制劑有望成為治療腎臟纖維化的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

為驗(yàn)證我們的新假說，我們擬從以下三部分進(jìn)行研究

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 Graphpad Prism 5 軟件，數(shù)據(jù)的表現(xiàn)形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t 檢驗(yàn)， p < 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3 結(jié)果3.1 miR-150 在 LN 腎組織中的表達(dá)與定位miR-150 在始發(fā)未治的狼瘡腎炎患者腎組織中高表達(dá)，主要定位在腎小管上皮細(xì)胞，部分表達(dá)在足細(xì)胞，少量表達(dá)在系膜細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2682171