【摘要】：腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)起病急、進展快,是臨床上引起急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)的重要原因,其易轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I功能不全,死亡率高,且近年來發(fā)病率逐年遞增。腎IRI的發(fā)病機制復雜,多種機制參與了其發(fā)生發(fā)展,對其防治帶來困難,目前治療的藥物僅限于對癥治療,對腎功能的改善有限。因此找到參與腎IRI損傷的關鍵分子用于腎IRI的防治具有重要的理論意義和實際應用價值。PDCD4(Programmed Cell Death 4,程序性細胞死亡因4),是重要的抑癌基因,關于PDCD4的研究主要集中于腫瘤相關疾病中,而在腎缺血再灌注損傷中的作用及深入機制尚不明確。大量研究表明PDCD4主要通過與靶基因mRNA編碼區(qū)域結(jié)合,抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程,進而影響細胞生物學功能,影響許多腫瘤及相關疾病的發(fā)展進程。最新研究發(fā)現(xiàn),PDCD4與糖脂代謝及炎癥關系密切,提示PDCD4有可能在其他生理或病理情況下發(fā)揮重要作用。同時,大量研究表明,腎小管細胞死亡和炎癥相互促進的過程在急性腎損傷時發(fā)揮關鍵作用,PDCD4在腎缺血再灌注損傷中是否發(fā)揮重要作用及具體機制值得進一步深入探討。研究目的:1.通過體內(nèi)動物實驗和體外細胞實驗明確PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機制。2.闡明PDCD4在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用的分子機制,找到參與腎缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的關鍵靶點,用于腎缺血再灌注損傷的臨床防治。方法:第一部分:PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的表達分布及作用1.1 PDCD4在缺血再灌注損傷中的表達變化及作用1.1.1 PDCD4在C57BL/6J野生型(WT)小鼠不同組織器官及腎臟不同細胞系中的表達蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)檢測C57BL/6J小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腸、睪丸中PDCD4蛋白表達,同時檢測腎臟不同細胞系,即大鼠腎小球系膜細胞(RMC)、大鼠腎小球內(nèi)皮細胞(GENC)、人足細胞(HPC)、大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)中PDCD4的蛋白表達。1.1.2建立小鼠腎缺血再灌注損傷疾病模型,檢測PDCD4的表達變化選用12周齡C57BL/6J雄性鼠建立急性腎缺血再灌注模型,應用實時熒光定量PCR(Real-time RT-PCR)、WB、免疫組化染色(Immunohistochemical-staining,IHC),分別檢測PDCD4在缺血再灌注后不同時間點,即24h、48h、72h時mRNA和蛋白水平的表達變化。同時通過免疫熒光(Immunofluoresce,IF)雙標的方法檢測PDCD4在腎臟近曲小管、遠曲小管、集合管的表達分布情況及腎缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)時的表達變化。1.1.3檢測PDCD4在急性腎小管壞死病人腎臟中的表達情況IHC檢測臨床上腎癌病人癌旁組織切片與急性腎小管壞死病人腎活檢切片中PDCD4的表達水平與分布。1.1.4體外構(gòu)建不同的缺氧損傷模型檢測PDCD4的表達變化使用NRK-52E通過不同刺激方法,體外模擬腎缺血再灌注損傷,主要采用三種實驗方法:①糖氧剝奪實驗(OGD),即采用無糖無血清培養(yǎng)基在缺氧條件下培養(yǎng)細胞2h后,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),收24h,48h,72h的細胞進行檢測;②細胞用含有抗霉素A和2-缺氧葡萄糖(AA/2-DG)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)60min后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,48h及72h;③細胞在含有50μm,200μm和500μm氯化鈷的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。WB檢測在這三種體外缺氧損傷條件下,PDCD4蛋白水平的表達變化。1.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機制1.2.1 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用將C57BL/6JWT雄性小鼠和PDCD4-/-敲基因小鼠隨機分組,構(gòu)建腎急性缺血再灌注損傷疾病模型。在缺血45min后再灌注不同時間點取材,利用高效液相色譜法(HPLC)檢測血清中肌酐含量、全自動生化分析儀檢測血清中尿素氮含量、蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL染色)等方法明確PDCD4在腎臟缺血再灌注損傷中的生物學作用。1.2.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用機制Real-time RT-PCR檢測WT和PDCD4-/-小鼠對照組與模型組腎臟組織中代表性炎癥因子IL-1β,TNF-α,IL-6及MCP-1的mRNA變化。CD68標記巨噬細胞,Ly6B標記中性粒細胞,應用IF檢測WT與PDCD4-/-小鼠對照組與模型組腎臟組織中的巨噬細胞及中性粒細胞的分布及變化。第二部分PDCD4通過調(diào)控Fgr-Notch1信號通路引起腎缺血再灌注損傷2.1 PDCD4通過Fgr參與腎缺血再灌注損傷2.1.1體內(nèi)驗證PDCD4通過Fgr調(diào)控腎臟缺血再灌注損傷通過基因芯片技術(shù)分析腎缺血再灌注損傷時WT和PDCD4-/-小鼠間的差異表達基因,并繪制差異基因表達變化熱圖。Real-time RT-PCR、WB和IHC檢測WT和PDCD4-/-小鼠對照組與模型組腎臟組織中Fgr mRNA及蛋白水平變化。2.1.2體外OGD驗證PDCD4通過Fgr調(diào)控腎臟缺血再灌注損傷Real-time RT-PCR及WB檢測OGD后不同時間點Fgr的變化,同時沉默PDCD4后Fgr mRNA及蛋白水平的變化。通過體外過表達PDCD4后沉默F(xiàn)gr,應用Real-time RT-PCR檢測細胞因子的變化,應用流式及Caspse3活性檢測,明確PDCD4體外對腎小管細胞炎癥和凋亡的影響是否通過Fgr。2.2 PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號通路2.2.1體內(nèi)外驗證PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號通路Real-time RT-PCR、WB和IHC檢測WT和PDCD4-/-小鼠對照組與模型組腎臟組織中Notch1 mRNA及蛋白水平變化。體外實驗通過WB檢測OE-PDCD4后siRNA-Fgr對NRK-52E細胞中Notch1蛋白表達水平的影響,明確PDCD4是否通過Fgr調(diào)控Notch1。2.2.2小鼠腎臟局部過表達Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎缺血再灌注損傷中的保護作用將WT和PDCD4-/-敲基因小鼠隨機分組,局部注射過表達帶GFP標簽的Fgr腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,一個月后建立腎缺血再灌注損傷模型。在缺血45min后不同的再灌注時間點取材,HPLC檢測血清中肌酐含量、全自動生化分析儀檢測血清中尿素氮含量、HE染色、TUNEL染色等方法明確過表達Fgr是否可以逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在急性缺血再灌注損傷中的保護作用。Real-time RT-PCR檢測細胞因子的表達,WB檢測下游基因Notch1的表達。結(jié)果:第一部分:PDCD4在急性腎缺血再灌注損傷中的表達分布及作用1.1 PDCD4在腎缺血再灌注損傷組織中表達顯著升高1.1.1 PDCD4在WT小鼠不同器官組織以及腎臟細胞系中的表達變化WB檢測結(jié)果顯示PDCD4在WT小鼠腎臟中表達豐富,進一步檢測腎臟各細胞系結(jié)果顯示:與RMC、GENC、HPC相比PDCD4在NRK-52E中表達更豐富,提示其可能在腎臟中發(fā)揮重要作用。1.1.2小鼠腎缺血再灌注損傷后PDCD4在近曲小管和集合管中表達顯著升高Real-time RT-PCR結(jié)果顯示在缺血再灌注損傷后48h,72h PDCD4在mRNA水平顯著升高,同時WB以及IHC結(jié)果顯示與WT組相比PDCD4蛋白表達顯著升高。免疫熒光雙標結(jié)果顯示,在腎缺血再灌注損傷時PDCD4主要在近曲小管和集合管中蛋白表達顯著升高。1.1.3 PDCD4在急性腎小管壞死病人腎活檢標本中的表達顯著升高IHC結(jié)果顯示,與腎癌癌旁組織相比急性腎小管壞死病人腎活檢切片中PDCD4表達顯著升高。1.1.4 PDCD4在體外缺氧模型中表達顯著升高WB結(jié)果顯示,PDCD4在OGD,AA/2-DG,CoC12三種刺激條件下,PDCD4蛋白表達均顯著升高。1.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機制1.2.1 PDCD4的缺失顯著減輕腎缺血再灌注損傷與WT小鼠相比,PDCD4-/-小鼠在缺血再灌注損傷后48h,血清中肌酐、尿素氮含量明顯降低;HE染色結(jié)果顯示,PDCD4缺失后腎臟形態(tài)學損傷減輕,主要表現(xiàn)為腎小管上皮細胞空泡樣變性減少,腎小管擴張程度減輕,管型形成減少;TUNEL染色結(jié)果顯示,PDCD4缺失后腎小管上皮細胞的死亡顯著減少。1.2.2 PDCD4通過介導炎癥反應加重腎缺血再灌注損傷Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,PDCD4缺失后,腎缺血再灌注組腎臟組織中炎癥因子mRNA表達顯著減少;IF結(jié)果顯示,PDCD4缺失后,腎臟組織中中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤顯著減少。第二部分PDCD4通過調(diào)控Fgr-Notch1信號通路引起腎缺血再灌注損傷2.1 PDCD4通過Fgr調(diào)控腎缺血再灌注損傷2.1.1體內(nèi)實驗結(jié)果顯示PDCD4通過Fgr調(diào)控腎缺血再灌注損傷基因芯片結(jié)果分析顯示,在腎缺血再灌注損傷時,Fgr顯著升高,而PDCD4的缺失可以顯著下調(diào)Fgr,提示PDCD4加重腎缺血再灌注損傷可能是通過Fgr發(fā)揮作用。進一步通過Real-time RT-PCR、WB和IHC驗證,得出了與基因芯片一致的結(jié)論。2.1.2體外OGD實驗表明PDCD4通過Fgr調(diào)控腎小管細胞的炎癥和凋亡OGD后不同時間點,Real-time RT-PCR及WB結(jié)果顯示,Fgr在mRNA及蛋白表達顯著升高,同時沉默PDCD4后Fgr在mRNA及蛋白水平上顯著下降。體外過表達PDCD4后沉默F(xiàn)gr,在OGD條件下Real-time RT-PCR檢測細胞因子的結(jié)果提示沉默F(xiàn)gr可顯著抑制PDCD4引起的NRK-52E細胞炎癥因子的表達,流式及Caspse3活性檢測結(jié)果表明沉默F(xiàn)gr可顯著抑制過表達PDCD4對NRK-52E細胞凋亡誘導。2.2 PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號通路2.2.1體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號通路基因芯片結(jié)果分析顯示,在腎缺血再灌注損傷時,Notch1表達顯著升高,PDCD4的缺失顯著抑制了缺血再灌注損傷誘導的Notch1表達。體內(nèi)進一步用Real-time RT-PCR、WB和IHC進行驗證得到了與芯片一致的結(jié)果。體外實驗結(jié)果顯示,ODG條件下Notch1在mRNA和蛋白表達水平上均顯著升高,siRNA-Fgr可顯著下調(diào)Notch1表達。體內(nèi)外實驗結(jié)果提示,PDCD4可能通過Fgr調(diào)控Notch1信號通路。2.2.2小鼠腎臟局部過表達Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎缺血再灌注損傷中的保護作用局部注射過表達帶GFP標簽的Fgr腺相關病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,WB結(jié)果顯示,一個月后與對照組相比AAV-Fgr-GFP組Fgr表達顯著升高。血清肌酐、尿素氮、HE染色、TUNEL染色、炎癥因子檢測等結(jié)果顯示,過表達Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用。結(jié)論與創(chuàng)新性1.闡述了PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用,實驗結(jié)果表明在腎缺血再灌注損傷中,敲除PDCD4可以通過減輕炎癥細胞的浸潤和炎性因子的釋放,減少小管上皮細胞的凋亡減輕急性腎損傷。2.本實驗首次發(fā)現(xiàn)PDCD4可能是通過Fgr-Notch1信號通路調(diào)控腎缺血再灌注損傷,明確了PDCD4通過調(diào)控Fgr影響Notch1的表達來加重急性腎損傷的疾病進程,為尋找防治急性腎損傷作用靶點提供了重要的理論支持和實驗基礎。
【圖文】：

細胞系即ＲＭＣ、ＧＥＮＣ、ＨＰＣ、ＮＲＫ－５２Ｅ中ＰＤＣＤ４的蛋白表達，，實驗結(jié)果逡逑明，ＰＤＣＤ４在腎臟組織中表達豐富（圖１．１．１ａ）。與腎臟其他細胞系相比，逡逑ＤＣＤ４在ＮＲＫ－５２Ｅ細胞中表達更豐富（圖１．１．１ｂ）。提示其在腎臟可能中發(fā)揮逡逑要的作用。逡逑

邐山東大學碩士學位論文邐逡逑ｃａｌｂｉｎｄｉｎＤ２８ｋ、ＡＱＰ３進行免疫熒光雙標，其中ＰＤＣＤ４顯示綠色，標記蛋白顯逡逑示紅色。結(jié)果顯示，發(fā)生缺血再灌損傷時，ＰＤＣＤ４在近曲小管與集合管中表達逡逑升高明顯（圖１．１．２ｄ）。逡逑ａ邋＾邋５－１邐＊逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2681636