【摘要】：腎缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)起病急、進(jìn)展快,是臨床上引起急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)的重要原因,其易轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I功能不全,死亡率高,且近年來發(fā)病率逐年遞增。腎IRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多種機(jī)制參與了其發(fā)生發(fā)展,對(duì)其防治帶來困難,目前治療的藥物僅限于對(duì)癥治療,對(duì)腎功能的改善有限。因此找到參與腎IRI損傷的關(guān)鍵分子用于腎IRI的防治具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。PDCD4(Programmed Cell Death 4,程序性細(xì)胞死亡因4),是重要的抑癌基因,關(guān)于PDCD4的研究主要集中于腫瘤相關(guān)疾病中,而在腎缺血再灌注損傷中的作用及深入機(jī)制尚不明確。大量研究表明PDCD4主要通過與靶基因mRNA編碼區(qū)域結(jié)合,抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程,進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)功能,影響許多腫瘤及相關(guān)疾病的發(fā)展進(jìn)程。最新研究發(fā)現(xiàn),PDCD4與糖脂代謝及炎癥關(guān)系密切,提示PDCD4有可能在其他生理或病理情況下發(fā)揮重要作用。同時(shí),大量研究表明,腎小管細(xì)胞死亡和炎癥相互促進(jìn)的過程在急性腎損傷時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用,PDCD4在腎缺血再灌注損傷中是否發(fā)揮重要作用及具體機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討。研究目的:1.通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制。2.闡明PDCD4在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用的分子機(jī)制,找到參與腎缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶點(diǎn),用于腎缺血再灌注損傷的臨床防治。方法:第一部分:PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的表達(dá)分布及作用1.1 PDCD4在缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化及作用1.1.1 PDCD4在C57BL/6J野生型(WT)小鼠不同組織器官及腎臟不同細(xì)胞系中的表達(dá)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot,WB)檢測C57BL/6J小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腸、睪丸中PDCD4蛋白表達(dá),同時(shí)檢測腎臟不同細(xì)胞系,即大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMC)、大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(GENC)、人足細(xì)胞(HPC)、大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)中PDCD4的蛋白表達(dá)。1.1.2建立小鼠腎缺血再灌注損傷疾病模型,檢測PDCD4的表達(dá)變化選用12周齡C57BL/6J雄性鼠建立急性腎缺血再灌注模型,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time RT-PCR)、WB、免疫組化染色(Immunohistochemical-staining,IHC),分別檢測PDCD4在缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn),即24h、48h、72h時(shí)mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。同時(shí)通過免疫熒光(Immunofluoresce,IF)雙標(biāo)的方法檢測PDCD4在腎臟近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管的表達(dá)分布情況及腎缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)時(shí)的表達(dá)變化。1.1.3檢測PDCD4在急性腎小管壞死病人腎臟中的表達(dá)情況IHC檢測臨床上腎癌病人癌旁組織切片與急性腎小管壞死病人腎活檢切片中PDCD4的表達(dá)水平與分布。1.1.4體外構(gòu)建不同的缺氧損傷模型檢測PDCD4的表達(dá)變化使用NRK-52E通過不同刺激方法,體外模擬腎缺血再灌注損傷,主要采用三種實(shí)驗(yàn)方法:①糖氧剝奪實(shí)驗(yàn)(OGD),即采用無糖無血清培養(yǎng)基在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞2h后,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),收24h,48h,72h的細(xì)胞進(jìn)行檢測;②細(xì)胞用含有抗霉素A和2-缺氧葡萄糖(AA/2-DG)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)60min后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,48h及72h;③細(xì)胞在含有50μm,200μm和500μm氯化鈷的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。WB檢測在這三種體外缺氧損傷條件下,PDCD4蛋白水平的表達(dá)變化。1.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制1.2.1 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用將C57BL/6JWT雄性小鼠和PDCD4-/-敲基因小鼠隨機(jī)分組,構(gòu)建腎急性缺血再灌注損傷疾病模型。在缺血45min后再灌注不同時(shí)間點(diǎn)取材,利用高效液相色譜法(HPLC)檢測血清中肌酐含量、全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中尿素氮含量、蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL染色)等方法明確PDCD4在腎臟缺血再灌注損傷中的生物學(xué)作用。1.2.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制Real-time RT-PCR檢測WT和PDCD4-/-小鼠對(duì)照組與模型組腎臟組織中代表性炎癥因子IL-1β,TNF-α,IL-6及MCP-1的mRNA變化。CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞,Ly6B標(biāo)記中性粒細(xì)胞,應(yīng)用IF檢測WT與PDCD4-/-小鼠對(duì)照組與模型組腎臟組織中的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的分布及變化。第二部分PDCD4通過調(diào)控Fgr-Notch1信號(hào)通路引起腎缺血再灌注損傷2.1 PDCD4通過Fgr參與腎缺血再灌注損傷2.1.1體內(nèi)驗(yàn)證PDCD4通過Fgr調(diào)控腎臟缺血再灌注損傷通過基因芯片技術(shù)分析腎缺血再灌注損傷時(shí)WT和PDCD4-/-小鼠間的差異表達(dá)基因,并繪制差異基因表達(dá)變化熱圖。Real-time RT-PCR、WB和IHC檢測WT和PDCD4-/-小鼠對(duì)照組與模型組腎臟組織中Fgr mRNA及蛋白水平變化。2.1.2體外OGD驗(yàn)證PDCD4通過Fgr調(diào)控腎臟缺血再灌注損傷Real-time RT-PCR及WB檢測OGD后不同時(shí)間點(diǎn)Fgr的變化,同時(shí)沉默PDCD4后Fgr mRNA及蛋白水平的變化。通過體外過表達(dá)PDCD4后沉默F(xiàn)gr,應(yīng)用Real-time RT-PCR檢測細(xì)胞因子的變化,應(yīng)用流式及Caspse3活性檢測,明確PDCD4體外對(duì)腎小管細(xì)胞炎癥和凋亡的影響是否通過Fgr。2.2 PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號(hào)通路2.2.1體內(nèi)外驗(yàn)證PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號(hào)通路Real-time RT-PCR、WB和IHC檢測WT和PDCD4-/-小鼠對(duì)照組與模型組腎臟組織中Notch1 mRNA及蛋白水平變化。體外實(shí)驗(yàn)通過WB檢測OE-PDCD4后siRNA-Fgr對(duì)NRK-52E細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平的影響,明確PDCD4是否通過Fgr調(diào)控Notch1。2.2.2小鼠腎臟局部過表達(dá)Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用將WT和PDCD4-/-敲基因小鼠隨機(jī)分組,局部注射過表達(dá)帶GFP標(biāo)簽的Fgr腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,一個(gè)月后建立腎缺血再灌注損傷模型。在缺血45min后不同的再灌注時(shí)間點(diǎn)取材,HPLC檢測血清中肌酐含量、全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中尿素氮含量、HE染色、TUNEL染色等方法明確過表達(dá)Fgr是否可以逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在急性缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。Real-time RT-PCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá),WB檢測下游基因Notch1的表達(dá)。結(jié)果:第一部分:PDCD4在急性腎缺血再灌注損傷中的表達(dá)分布及作用1.1 PDCD4在腎缺血再灌注損傷組織中表達(dá)顯著升高1.1.1 PDCD4在WT小鼠不同器官組織以及腎臟細(xì)胞系中的表達(dá)變化WB檢測結(jié)果顯示PDCD4在WT小鼠腎臟中表達(dá)豐富,進(jìn)一步檢測腎臟各細(xì)胞系結(jié)果顯示:與RMC、GENC、HPC相比PDCD4在NRK-52E中表達(dá)更豐富,提示其可能在腎臟中發(fā)揮重要作用。1.1.2小鼠腎缺血再灌注損傷后PDCD4在近曲小管和集合管中表達(dá)顯著升高Real-time RT-PCR結(jié)果顯示在缺血再灌注損傷后48h,72h PDCD4在mRNA水平顯著升高,同時(shí)WB以及IHC結(jié)果顯示與WT組相比PDCD4蛋白表達(dá)顯著升高。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示,在腎缺血再灌注損傷時(shí)PDCD4主要在近曲小管和集合管中蛋白表達(dá)顯著升高。1.1.3 PDCD4在急性腎小管壞死病人腎活檢標(biāo)本中的表達(dá)顯著升高IHC結(jié)果顯示,與腎癌癌旁組織相比急性腎小管壞死病人腎活檢切片中PDCD4表達(dá)顯著升高。1.1.4 PDCD4在體外缺氧模型中表達(dá)顯著升高WB結(jié)果顯示,PDCD4在OGD,AA/2-DG,CoC12三種刺激條件下,PDCD4蛋白表達(dá)均顯著升高。1.2 PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制1.2.1 PDCD4的缺失顯著減輕腎缺血再灌注損傷與WT小鼠相比,PDCD4-/-小鼠在缺血再灌注損傷后48h,血清中肌酐、尿素氮含量明顯降低;HE染色結(jié)果顯示,PDCD4缺失后腎臟形態(tài)學(xué)損傷減輕,主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性減少,腎小管擴(kuò)張程度減輕,管型形成減少;TUNEL染色結(jié)果顯示,PDCD4缺失后腎小管上皮細(xì)胞的死亡顯著減少。1.2.2 PDCD4通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重腎缺血再灌注損傷Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,PDCD4缺失后,腎缺血再灌注組腎臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)顯著減少;IF結(jié)果顯示,PDCD4缺失后,腎臟組織中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤顯著減少。第二部分PDCD4通過調(diào)控Fgr-Notch1信號(hào)通路引起腎缺血再灌注損傷2.1 PDCD4通過Fgr調(diào)控腎缺血再灌注損傷2.1.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCD4通過Fgr調(diào)控腎缺血再灌注損傷基因芯片結(jié)果分析顯示,在腎缺血再灌注損傷時(shí),Fgr顯著升高,而PDCD4的缺失可以顯著下調(diào)Fgr,提示PDCD4加重腎缺血再灌注損傷可能是通過Fgr發(fā)揮作用。進(jìn)一步通過Real-time RT-PCR、WB和IHC驗(yàn)證,得出了與基因芯片一致的結(jié)論。2.1.2體外OGD實(shí)驗(yàn)表明PDCD4通過Fgr調(diào)控腎小管細(xì)胞的炎癥和凋亡OGD后不同時(shí)間點(diǎn),Real-time RT-PCR及WB結(jié)果顯示,Fgr在mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高,同時(shí)沉默PDCD4后Fgr在mRNA及蛋白水平上顯著下降。體外過表達(dá)PDCD4后沉默F(xiàn)gr,在OGD條件下Real-time RT-PCR檢測細(xì)胞因子的結(jié)果提示沉默F(xiàn)gr可顯著抑制PDCD4引起的NRK-52E細(xì)胞炎癥因子的表達(dá),流式及Caspse3活性檢測結(jié)果表明沉默F(xiàn)gr可顯著抑制過表達(dá)PDCD4對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。2.2 PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號(hào)通路2.2.1體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDCD4通過Fgr調(diào)控Notch1信號(hào)通路基因芯片結(jié)果分析顯示,在腎缺血再灌注損傷時(shí),Notch1表達(dá)顯著升高,PDCD4的缺失顯著抑制了缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的Notch1表達(dá)。體內(nèi)進(jìn)一步用Real-time RT-PCR、WB和IHC進(jìn)行驗(yàn)證得到了與芯片一致的結(jié)果。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ODG條件下Notch1在mRNA和蛋白表達(dá)水平上均顯著升高,siRNA-Fgr可顯著下調(diào)Notch1表達(dá)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,PDCD4可能通過Fgr調(diào)控Notch1信號(hào)通路。2.2.2小鼠腎臟局部過表達(dá)Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用局部注射過表達(dá)帶GFP標(biāo)簽的Fgr腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)即AAV-Fgr-GFP,WB結(jié)果顯示,一個(gè)月后與對(duì)照組相比AAV-Fgr-GFP組Fgr表達(dá)顯著升高。血清肌酐、尿素氮、HE染色、TUNEL染色、炎癥因子檢測等結(jié)果顯示,過表達(dá)Fgr可逆轉(zhuǎn)PDCD4缺失在腎臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。結(jié)論與創(chuàng)新性1.闡述了PDCD4在腎缺血再灌注損傷中的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在腎缺血再灌注損傷中,敲除PDCD4可以通過減輕炎癥細(xì)胞的浸潤和炎性因子的釋放,減少小管上皮細(xì)胞的凋亡減輕急性腎損傷。2.本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)PDCD4可能是通過Fgr-Notch1信號(hào)通路調(diào)控腎缺血再灌注損傷,明確了PDCD4通過調(diào)控Fgr影響Notch1的表達(dá)來加重急性腎損傷的疾病進(jìn)程,為尋找防治急性腎損傷作用靶點(diǎn)提供了重要的理論支持和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

細(xì)胞系即ＲＭＣ、ＧＥＮＣ、ＨＰＣ、ＮＲＫ－５２Ｅ中ＰＤＣＤ４的蛋白表達(dá)，，實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑明，ＰＤＣＤ４在腎臟組織中表達(dá)豐富（圖１．１．１ａ）。與腎臟其他細(xì)胞系相比，逡逑ＤＣＤ４在ＮＲＫ－５２Ｅ細(xì)胞中表達(dá)更豐富（圖１．１．１ｂ）。提示其在腎臟可能中發(fā)揮逡逑要的作用。逡逑

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑ｃａｌｂｉｎｄｉｎＤ２８ｋ、ＡＱＰ３進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)，其中ＰＤＣＤ４顯示綠色，標(biāo)記蛋白顯逡逑示紅色。結(jié)果顯示，發(fā)生缺血再灌損傷時(shí)，ＰＤＣＤ４在近曲小管與集合管中表達(dá)逡逑升高明顯（圖１．１．２ｄ）。逡逑ａ邋＾邋５－１邐＊逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692

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1 王t舉

本文編號(hào)：2681636