【摘要】：目的:1.探索細(xì)胞外ATP在腎缺血再灌注性損傷(I/R)中的作用,明確其是否可以誘導(dǎo)腎臟炎癥;2.觀察e ATP是否通過P2X7R誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥;3.探索e ATP/P2X7R是否通過NLRP3炎癥體參與腎臟I/R損傷。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):雄性C57BL/6小鼠及P2X7R(-/-)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和I/R組,野生型小鼠術(shù)后30min尾靜脈注射Apyrase或A438079治療。通過一側(cè)腎切對側(cè)腎蒂夾閉35min建立AKI模型。造模后24h收集小鼠尿、血清及腎組織。體外實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2),予低氧24h/復(fù)氧8h(H/R)或ATP 4m M 8h處理。給予不同濃度Apyrase處理。通過轉(zhuǎn)染P2X7R si RNA或NLRP3si RNA觀察P2X7R及NLRP3對細(xì)胞H/R及ATP損傷的影響。生化方法檢測小鼠血清肌酐、尿素氮水平。PAS染色觀察腎結(jié)構(gòu)損害;化學(xué)發(fā)光法檢測尿及細(xì)胞上清ATP水平;免疫組化或免疫熒光染色定位腎組織ATP5a、ATP5b、IL-18、cleaved caspase-1、F4/80、IL-1 beta、CD68、P2X7R、NLRP3的表達(dá);real-time PCR及免疫印跡檢測腎組織ATP合成酶、P2X7R、NLRP3炎癥體、IL-1 beta的基因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):腎臟I/R誘導(dǎo)小鼠尿ATP水平升高但ATP合酶表達(dá)無明顯變化。I/R小鼠腎功能下降,腎臟結(jié)構(gòu)損害,炎癥因子及炎癥細(xì)胞浸潤增加,Apyrase治療后改善。I/R組小鼠腎臟NLRP3、cleaved caspase-1水平增多,Apyrase或A438079治療后降低。另外,P2X7R(-/-)I/R小鼠腎功能、腎臟炎癥因子及因子細(xì)胞浸潤較野生型小鼠相比明顯改善。體外實(shí)驗(yàn):H/R誘導(dǎo)HK2細(xì)胞ATP釋放增多,IL-1 beta m RNA及IL-1 beta蛋白活化水平增加,Apyrase處理后改善,P2X7R si RNA轉(zhuǎn)染或NLRP3 si RNA轉(zhuǎn)染后改善。P2X7R si RNA轉(zhuǎn)染還降低H/R誘導(dǎo)的NLRP3、ASC、cleaved caspase-1表達(dá)升高。結(jié)論:降低細(xì)胞外ATP水平或P2X7R基因敲除通過抑制腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎癥體活化改善腎臟缺血再灌注損傷,并降低腎臟炎癥。
【圖文】：

43 圖 1.1 小鼠腎臟 I/R 后腎功能及組織學(xué)改變。C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為 Sham 組及 I/R 組。A.腎功能；B.PAS 染 （200X，上組圖）及 IL-18 免疫組化染 （200X，，下組圖）。***表示和 Sham 組比較，p<0.001。白 箭頭顯示腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落、堵塞管腔、基底膜裸露； 箭頭顯示小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。Figure 1.1 The changes of renal function and histopathology after renal I/R injury.1.2.1.2 I/R 誘導(dǎo)小鼠腎組織炎癥因子表達(dá)增多、炎癥細(xì)胞浸潤增加如圖 1.2A 所示，小鼠經(jīng)腎臟 I/R 損傷后腎組織 IL-1 beta mRNA 表達(dá)水平和 Sham 組小鼠相比增多約 3 倍（p<0.01）。如圖 1.2B 所示，I/R 組小鼠腎組織IL-1 beta 前體蛋白（p31 片段）表達(dá)和 Sham 組相比增加，同時(shí) IL-1 beta 的

活化片段（p17）也較 Sham 組小鼠增加。免疫熒光結(jié)果(圖 1.2C)顯示，I/R 組小鼠腎間質(zhì) F4/80＋炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量較 Sham 組相比明顯增加。同時(shí) CD68 和 IL-1 beta 免疫熒光共染結(jié)果顯示 I/R組小鼠 IL-1 beta 表達(dá)水平增高，CD68＋細(xì)胞浸潤增多，并且 IL-1 beta 和 CD68聚集在相似區(qū)域。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692

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1 錢盈盈;eATP-P2X7R信號在腎缺血再灌注性損傷中的作用機(jī)制[D];上海交通大學(xué);2018年

本文編號：2680563