【摘要】：(1)體內(nèi)研究目的:建立醛固酮誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型,體內(nèi)觀察Cx43、氧化應(yīng)激和ERS對(duì)足細(xì)胞的作用。方法:將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組:對(duì)照組(n=6,假手術(shù)組,1%Na Cl飲水);醛固酮模型組(n=6,右腎摘除術(shù),1%Na Cl飲水,兩周后醛固酮微泵以0.75μg/h持續(xù)泵入);醛固酮+Cx43 SCR組(n=6,右腎摘除術(shù),1%Na Cl飲水,兩周后醛固酮微泵以0.75μg/h持續(xù)泵入,50μMCx43 SCR的微泵);醛固酮+Cx43 AS組(n=6,右腎摘除術(shù),1%Na Cl飲水,兩周后醛固酮微泵以0.75μg/h持續(xù)泵入,50μMCx43 AS的微泵)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)及第4周測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓,實(shí)驗(yàn)第4周結(jié)束前一天開(kāi)始使用代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液,測(cè)定尿蛋白排泄率(ELISA法);腎組織石蠟固定,病理切片,檢測(cè)腎小球內(nèi)足細(xì)胞的凋亡情況(TUNEL法);檢測(cè)腎小球Cx43、Casepase12、WT1和NOX4變化(免疫熒光和免疫組化法);Western blot法檢測(cè)腎組織中Caspase12、GRP78、NOX4、Cx43、Bax和Bcl-2等表達(dá)水平的變化。DHE染色檢測(cè)腎臟活性氧的產(chǎn)生。結(jié)果:與對(duì)照組相比,醛固酮模型組收縮壓、24小時(shí)尿量、尿蛋白/肌酐、腎重量/體重值均明顯增高,氧化應(yīng)激指標(biāo)(DHE染色和NOX4表達(dá))升高,ERS標(biāo)志蛋白(GRP78和Caspase12)的表達(dá)升高,Cx43表達(dá)升高。同時(shí),醛固酮模型組TUNEL法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,免疫熒光WT1染色提示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,上述結(jié)果均提示足細(xì)胞損傷。與醛固酮+Cx43 SCR組相比,Cx43 AS干預(yù)組Cx43表達(dá)減少,TUNEL法提示足細(xì)胞凋亡數(shù)減少,WT1染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,氧化應(yīng)激指標(biāo)(DHE染色)降低,ERS標(biāo)志蛋白(GRP78和Caspase12)的表達(dá)降低。(2)體外研究目的:體外培養(yǎng)大鼠足細(xì)胞,醛固酮干預(yù)后觀察氧化應(yīng)激、ERS和Cx43在足細(xì)胞損傷中的作用。方法:體外培養(yǎng)足細(xì)胞株(MPC5),無(wú)干擾素-γ、37°C條件下誘導(dǎo)分化10~14d,不同濃度醛固酮(10-9M、10-8M、10-7M)和10-7 M醛固酮刺激足細(xì)胞12、24、36h等不同時(shí)間點(diǎn),Western blot法檢測(cè)Cx43、GRP78和Caspase12等表達(dá),結(jié)合使用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,氧化應(yīng)激抑制劑)、�；切苋パ跄懰�(TUDCA,ERS抑制劑)以及si RNA下調(diào)Cx43表達(dá)后,細(xì)胞凋亡酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況,Western blot法檢測(cè)GRP78、Caspase12、Bax和Bcl-2等表達(dá)變化,DCFDA探針檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量。結(jié)果:醛固酮可呈濃度(10-9M、10-8M、10-7M)和時(shí)間(12h、24h、36h)依賴性的促進(jìn)Cx43表達(dá);10-7M醛固酮刺激足細(xì)胞24h后,足細(xì)胞凋亡、ROS含量、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白(GRP78和Caspase12)、Bax/Bcl-2表達(dá)水平均明顯升高,NAC特異性抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)后,可減輕醛固酮誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和足細(xì)胞損傷,TUDCA特異性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,可減輕醛固酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和足細(xì)胞損傷,si RNA特異性下調(diào)Cx43后,可減輕醛固酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、ERS和足細(xì)胞損傷。小結(jié):(1)過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷;(2)氧化應(yīng)激的上調(diào)參與了醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷;(3)醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激相互作用,相互影響;(4)Cx43的表達(dá)上調(diào)參與了醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷;(5)Cx43可通過(guò)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。
【圖文】：

14圖 1 各組大鼠基本情況參數(shù)。（A）體重；（B）尿醛固酮水平；（C）尿量；（D）腎重量/體重比；（E）收；（F）尿白蛋白/肌酐；#P<0.05 vs. normal control,*P<0.05 vs. Aldo/salts or 3 SCR.1.4.2 醛固酮誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞損傷與對(duì)照組相比，Aldo/salt 組腎小球足細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加，詳見(jiàn)圖 2A、B，

圖 2：醛固酮增加大鼠足細(xì)胞損傷。A：TUNEL 檢測(cè)大鼠足細(xì)胞凋亡；B：腎小球足細(xì)胞凋亡數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；C：WT1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；D：腎小球足細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；#P<0.05 vs. normal control.1.4.3Cx43 表達(dá)上調(diào)參與醛固酮誘導(dǎo)的大鼠足細(xì)胞損傷免疫熒光結(jié)果顯示：和對(duì)照組相比，Aldo/salt 組腎小球內(nèi) Cx43 表達(dá)增多，詳見(jiàn)圖 3A，此外 Cx43 和足細(xì)胞標(biāo)志蛋白 Nephrin 共定位，這表明醛固酮激活了足細(xì)胞Cx43 信號(hào)通路。Western blot 結(jié)果表明醛固酮誘導(dǎo)的大鼠腎損傷模型中腎小球內(nèi) Cx43表達(dá)增多，詳見(jiàn)圖 3B，C。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 萬(wàn)姜敏;杜曉剛;;轉(zhuǎn)錄激活因子6在棕櫚酸誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中的作用[J];中華腎臟病雜志;2015年09期

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本文編號(hào)：2680450