發(fā)布時間：2020-05-23 20:04

【摘要】：膀胱癌為我國最常見的泌尿系惡性腫瘤,其發(fā)病率排在全世界惡性腫瘤的第6位,致死率排在第9位。其主要發(fā)生在膀胱移行上皮細胞,并且直接暴露于尿液,也稱為尿路上皮癌,膀胱癌中約70-75%為非肌層浸潤性(NMIBC),25-30%為肌層浸潤性(MIBC)。非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)的5年生存率可達90%以上。而肌層浸潤性膀胱癌的25~30%患者當(dāng)中,約5%已有遠處轉(zhuǎn)移,并且相當(dāng)比例(25%)的區(qū)域淋巴結(jié)已有轉(zhuǎn)移。局部晚期或轉(zhuǎn)移性病灶患者的5年生存率約為15%。其治療方法包括手術(shù)、膀胱灌注化療藥物及免疫治療等。膀胱鏡為檢測膀胱癌的有效工具。然而,該項檢查后容易出現(xiàn)一系列并發(fā)癥。為了更好的對膀胱癌進行診斷和治療隨訪,需要開發(fā)更加準確的生物標(biāo)志物。miRNA(MicroRNA)是一類非編碼小RNA分子,長度為17~25個核苷酸,它能通過堿基配對的方式與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補結(jié)合,從而調(diào)控靶基因的表達。研究表明,miRNA在多種惡性腫瘤中異常表達,可以控制很多癌癥相關(guān)過程,比如細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲。因此,探討膀胱癌中miRNA的表達及對生物學(xué)功能的影響,對進一步探索膀胱癌的發(fā)病機制,尋找新的靶點,具有重要意義。目的:觀察膀胱癌組織中miR-212的表達以及觀察上調(diào)miR-212后對癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響,研究miR-212是否通過調(diào)控HMGA2實現(xiàn)其作用。方法:取31例膀胱癌患者的膀胱癌病理組織標(biāo)本及配對癌旁正常組織,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-212和HMGA2的mRNA表達。用免疫組化法檢測HMGA2蛋白在膀胱癌及癌旁組織中的表達。人膀胱癌細胞T24分為miR-212組(轉(zhuǎn)染miR-212 mimics)以及對照組(轉(zhuǎn)染空白對照miR-212 NC)。在培養(yǎng)48 h后,用MTT比色法來檢測膀胱癌細胞的增殖能力,用Transwell實驗檢測癌細胞的侵襲及遷移能力,劃痕實驗檢測癌細胞的遷移能力,采用Western blotting法檢測膀胱癌細胞HMGA2蛋白表達。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-212的下游靶基因,并用熒光素酶報告基因驗證HMGA2是否為miR-212的直接靶基因。結(jié)果:膀胱癌組織中miR-212 mRNA表達低于癌旁正常組織(P0.05)。膀胱癌組織中HMGA2 mRNA表達高于癌旁正常組織(P0.05)。miR-212組細胞增殖、侵襲以及遷移能力均低于對照組(P均0.05)。miR-212組HMGA2蛋白表達低于對照組(P0.05)。在線數(shù)據(jù)庫結(jié)合熒光素酶報告實驗預(yù)測并且驗證了HMGA2是miR-212的下游靶基因。結(jié)論:膀胱癌組織中的miR-212呈低表達,而miR-212過表達可以抑制癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力,其作用同HMGA2密切相關(guān)。
【圖文】：

圖 6 pMIR-REPORT TM 質(zhì)粒圖譜2.2.6 上調(diào) miR-212 對膀胱癌細胞 HMGA2 表達的影響蛋白提取1）當(dāng)轉(zhuǎn)染 miR-212 表達質(zhì)粒的細胞處于生長對數(shù)期時，除去培養(yǎng)基，用 4℃PBS 洗 2 次。2）加胰消化 3min，在顯微鏡下見細胞充分離壁后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，將其轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管，800rpm 離心 3min，棄上清液。3）PBS 1mL 重懸細胞沉淀，后轉(zhuǎn)移至 1.5mL EP 管內(nèi)，再次 800rpm 離心 3m棄上清液。4）RIPA:磷酸化酶抑制劑：將 PMSF 按 100:1:1 配置為 RIPA 工作液，置于 4℃箱待用。5）取上述 RIPA 工作液 75μL 加入細胞中，超聲 3 次，每次 5s，充分混勻置于冰上反應(yīng) 15min，待其充分裂解。

3.1 免疫組化結(jié)果表明 HMGA2 在膀胱癌組織中高表達HMGA2 蛋白主要定位于細胞核和細胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色。在 31 例膀胱尿路上皮癌中 HMGA2 陽性表達 17 例，，陰性表達 14 例，陽性率 54.8%；31 例癌旁組織中 HMGA2 陽性表達 3 例，陰性表達 28 例，陽性率 9.7%（見表 1）。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，HMGA2 在膀胱癌組織中的表達顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果見圖 2。表 1 HMGA2 在不同組織中表達情況組別例數(shù) HMGA2病例數(shù) 陽性表達 (%) 陰性表達 (%) χ2值 p 值膀胱癌組 31 17(54.8%) 14(45.2%)癌旁組 31 3(9.7%) 28(90.3%) 14.467 0.000
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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本文編號：2677880