【摘要】：研究背景慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)患者體內(nèi)常存在脂代謝異常,且其在加重慢性腎臟病進展中起著重要作用。腎小球足細(xì)胞在維持腎小球濾過屏障的正常生理功能當(dāng)中,發(fā)揮了非常重要作用。足細(xì)胞的損傷、脫落和凋亡是高脂導(dǎo)致腎臟損害的重要機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是通過激活未折疊蛋白反應(yīng),繼而激活轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor-4,ATF4)、轉(zhuǎn)錄激活因子 6(activating transcription factor-6,ATF6)和,肌醇需求激酶-1(inositolrequiring enzyme-1,IRE1)的表達上調(diào),從而抑制蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯,同時促進未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的正確折疊,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),增加細(xì)胞的抗損傷能力。若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)過度激活,則會啟動細(xì)胞凋亡。既往有研究發(fā)現(xiàn),ATF4可以從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Parkin的表達。而Parkin與線粒體自噬以及細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切。但是ATF4是是否可通過調(diào)節(jié)Parkin的表達在高脂誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮保護作用仍不清楚,有待于進一步研究。目的本文研究了 ATF4通過調(diào)節(jié)Parkin在棕櫚酸誘導(dǎo)引起的腎小球足細(xì)胞凋亡中的作用,以闡明內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高脂誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中的作用,為臨床防治脂質(zhì)腎毒性提供新的實驗依據(jù)和理論支持。方法20只雄性SD大鼠隨機分為兩組:分別為普通飼料喂養(yǎng)的普通飲食組(N=10)及高脂飼料喂養(yǎng)的高脂飲食組(N=10),喂養(yǎng)12周后,處死動物,取其血清及腎臟標(biāo)本,送檢驗科檢測血清膽固醇及甘油三酯水平。采用油紅“O”染色法,觀察腎臟組織內(nèi)脂質(zhì)集聚的情況。在體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞株,待其分化完全后,用不同濃度PA刺激。采用Western印跡檢測腎組織及PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3表達,并采用Tunel染色法、流式細(xì)胞術(shù)分別觀察腎臟組織及PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞的凋亡的情況;采用免疫組化和Western印跡的方法,觀察動物腎臟組織及PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞Parkin及ATF4的表達。采用Parkin過表達質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,或shATF4腺病毒體外轉(zhuǎn)染足細(xì)胞,觀察其對PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞Parkin及其細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果(1)高脂飲食組血清甘油三酯及膽固醇水平顯著高于普通飲食組。此外,高脂飲食組腎小球有輕微的系膜增生,腎小管上皮細(xì)胞有脫落、壞死和凋亡、腎小管萎縮;高脂飲食組腎臟脂質(zhì)集聚增多,細(xì)胞凋亡增加。(2)在一定濃度范圍內(nèi),PA可增加足細(xì)胞的凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表達,且呈濃度依耐性。(3)與普通飲食組相比,高脂飲食組動物腎臟Parkin的表達明顯升高。同時,PA在一定濃度范圍內(nèi)可呈濃度依賴性誘導(dǎo)足細(xì)胞Parkin的表達升高。(4)Parkin過表達質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后,可明顯減少PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。(5)與普通飲食組相比,高脂飲食組動物腎臟ATF4的表達明顯升高。同時,PA在一定濃度范圍內(nèi)可呈濃度依賴性誘導(dǎo)足細(xì)胞ATF4的表達升高。(6)采用shATF4腺病毒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后,足細(xì)胞內(nèi)Parkin的表達下降,同時PA刺激的Cleaved-caspase3的表達升高及其細(xì)胞凋亡更為明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論(1)高脂可誘導(dǎo)腎臟損傷、脂質(zhì)集聚、ATF4和Parkin表達升高以及凋亡增多。(2)PA可誘導(dǎo)足細(xì)胞ATF4和Parkin表達升高以及凋亡增多。(3)ATF4可通過維持Parkin的表達從而改善PA誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用。但是Ｐａｒｋｉｎ是否參與高脂誘導(dǎo)的腎臟組織和足細(xì)胞逡逑凋亡的發(fā)生，仍未見報道。我們采用免疫組織化學(xué)染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ，發(fā)現(xiàn)高脂逡逑飲食喂養(yǎng)的大鼠腎臟Ｐａｒｋｉｎ的表達較普通飲食組明顯升高（尸＜０．０５）（見圖３．３Ａ、逡逑Ｂ邋及邋Ｃ、Ｄ）0逡逑同樣，在體外實驗中，我們采用ＰＡ刺激腎小球足細(xì)胞２４小時，免疫熒光染逡逑色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，，與正常對照組相比，ＰＡ組足細(xì)胞Ｐａｒｋｉｎ的表達較正常對照組升高逡逑２１逡逑

逡逑（尸＜０．０５）（見圖３．３Ｅ、Ｆ）；進一步采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)ＰＡ在一定濃逡逑度范圍內(nèi)可呈濃度依賴性地誘導(dǎo)足細(xì)胞Ｐａｒｋｉｎ表達升高（Ｐ＜０．０５）（見圖３．３Ｇ、Ｈ）。逡逑Ａ邐ＮＣＤ邐ＨＦＤ邐Ｂ逡逑ｇ邋ｈ邐＿逡逑一邐Ｉｓ－邐±逡逑｜邐ｉ－邐Ｉ逡逑－邐ｉＬＪＬ逡逑Ｃ邐Ｄ邋Ｃ邋２０－逡逑邐ＮＣＤ邐ＨＦＤ邐邋｜邋１－５－逡逑—二二二二Ｉ邐ｉ邐你邐＿邐＿逡逑ｐ－ａｃｔ邋叫—￡邐Ｓｉ邐ＳＳｆｔＷ逡逑ｉ＾曹懌■曹r>ｉ邐ｉ－５渞逡逑ｉ。N灥＿＿圈＿逡逑Ｅ邋＾＾ＤＡＰ＾＾＾＾Ｐａｒｋｉｒ＾＾＾ｌＶｌｅｒｇ＾＾＾邋ｐ邐，邐爹逡逑ｃｔｒ＾Ｈ＾ｍ邋ｉ逡逑ｉ邋２－邐１逡逑ｉ邋Ｊｐ邐Ｉ，逡逑Ｇ邐Ｈ邋＝邋２５ｌ逡逑邐ＰＡ（，ｏｌ／Ｌ＞邐邋！邋，0．邐ｌ逡逑＿邋０邐＿－Ｊ５０邐３００邐Ｉ邋１５．忐－｜逡逑Ｐａｒ１邋一邋口邋Ｓ：ｎｌｌ逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐１邋Ｊ１邋ｉ邋Ｗ邋ＩＩＩ逡逑邐Ｉ邐。屮＃＃逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐａｌｍｉｔｉｃ邋ａｃｉｄ（（ｉｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖３．３高脂飲食及ＰＡ誘導(dǎo)Ｐａｒｋｉｎ表達增加逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋Ｈｉｇｈ邋ｆａｔ邋ｄｉｅｔ邋ａｎｄ邋ｐａｌｍｉｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｐａｒｋｉｎ逡逑高脂飲食喂養(yǎng)ＳＤ大鼠１２周。ＮＣＤ：普通飲食喂養(yǎng)大鼠組（Ｎｏｒｍａｌ邋ｃｈｏｗ邋ｄｉｅｔ）；逡逑ＨＦＤ組：高脂飲食喂養(yǎng)大鼠組（Ｈｉｇｈ邋ｆａｔ邋ｄｉｅｔ）。（Ａ）懫用免疫組織化學(xué)染色法檢測大逡逑鼠腎臟組織Ｐａｒｋｉｎ的表達（４０0ｘ）；邋（Ｂ）對Ａ圖進行統(tǒng)計分析
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692

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1 吳s

本文編號：2673768