發(fā)布時(shí)間：2020-05-18 19:08

【摘要】：背景與目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以血糖代謝紊亂為特征的常見(jiàn)慢性疾病,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,目前已經(jīng)成為西方國(guó)家及我國(guó)一線城市終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的首位病因。高血糖作為DN發(fā)病的核心環(huán)節(jié),可激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,但具體機(jī)制仍不清楚。炎性小體這個(gè)概念由Tschopp研究小組于2002年首次提出,由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員NLRP3、銜接蛋白-凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)及效應(yīng)蛋白-半胱天冬酶-1(caspase-1)組成的蛋白復(fù)合物,參與2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。正常情況下,NLRP3炎性體處于靜止?fàn)顟B(tài),多種內(nèi)源性物質(zhì)如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、尿酸晶體、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、β-淀粉樣蛋白和溶酶體酶等和外源性物質(zhì)明礬、石棉和二氧化硅等均可激活NLRP3炎性體,NLRP3快速結(jié)合ASC進(jìn)而活化caspase-1,參與調(diào)控IL-1β、IL-18、IL-33等促炎因子的分泌。NLRP3炎性體在多種腎臟固有細(xì)胞中表達(dá),參與糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis,FGGS)、IgA腎病、急性腎損傷和急性腎盂腎炎等多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡致活性氧化物(以ROS為主)產(chǎn)生多于清除的的病理狀態(tài),參與糖尿病腎病的起病和發(fā)展。ROS主要來(lái)源于線粒體,也可來(lái)源于黃嘌呤氧化還原酶、環(huán)加氧酶、脂氧合酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(tinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶等,其中NADPH氧化酶主要在腎臟表達(dá),是腎皮質(zhì)ROS生成的主要來(lái)源。NLRP3炎性體的激活途徑主要包括:1)細(xì)胞內(nèi)鉀外流;2)溶酶體途徑;3)ROS產(chǎn)生。其中ROS逐漸成為NLRP3炎性體激活的共同途徑。研究表明高同型半胱氨酸血癥(hHcys)刺激NADPH氧化酶衍生大量ROS觸發(fā)NLRP3炎性體的形成和活化,從而產(chǎn)生IL-1β和其他因子致足細(xì)胞損傷。然而尚未見(jiàn)NOX4誘導(dǎo)NLRP3炎性體激活是否參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本課題以人腎小球足細(xì)胞(human glomerular podocyte,HPC)為研究對(duì)象,體外高糖環(huán)境模擬機(jī)體內(nèi)糖尿病條件,觀察高糖和NOX4特異性抑制劑GKT137831對(duì)人腎小球足細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)而探討NOX4介導(dǎo)的NLRP3炎性體激活參與足細(xì)胞的凋亡的可能機(jī)制。從而探尋早期糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制及延緩糖尿病腎病進(jìn)展的新治療靶點(diǎn)。方法體外常規(guī)培養(yǎng)HPC,實(shí)驗(yàn)分組為:1,正常糖組;2,甘露醇組;3,高糖組;4,高糖+抑制組。高糖濃度及抑制劑濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后熒光顯微鏡檢測(cè)足細(xì)胞ROS表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。Western-Blot法檢測(cè)NOX4蛋白、NLRP3炎性體蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)、足細(xì)胞特異性蛋白(nephrin、podocalyxin)和凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-1、Bax)的表達(dá)。結(jié)果與正常糖組相比,高糖增加足細(xì)胞內(nèi)NOX4和NLRP3表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與正常糖組相比,高糖組足細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增加,炎性體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)和凋亡蛋白Bax表達(dá)增加,而足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白(nephrin、podocalyxin)和抗凋亡蛋白Bcl-1表達(dá)減少,同時(shí)足細(xì)胞凋亡率增加;GKT 137831預(yù)處理能減弱足細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá),降低炎性體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)和凋亡蛋白Bax表達(dá)水平,部分恢復(fù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白(nephrin、podocalyxin)和抗凋亡蛋白Bcl-1的表達(dá),減低足細(xì)胞凋亡率。結(jié)論1.高糖誘導(dǎo)人腎小球足細(xì)胞NOX4高表達(dá)和NLRP3炎性體激活。2.抑制足細(xì)胞NOX4活性可減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

A B圖 1 高糖和 GKT137831 對(duì)足細(xì)胞增殖的影響注：葡萄糖呈濃度依賴(lài)性抑制人腎小球足細(xì)胞的增殖，葡萄糖濃度越高，對(duì)人腎小球足細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用越明顯，實(shí)驗(yàn)選取葡萄糖濃度 30mmol/l，即 IC25；GKT137831 可減弱葡萄糖對(duì)人腎小球足細(xì)胞的增殖毒性作用，在 20uM 時(shí)保護(hù)作用最明顯（*P<0.05）。

A B圖 2 高糖誘導(dǎo) NOX4 和 NLRP3 炎性體高表達(dá)注：1，，正常糖組 2，甘露醇組 3，高糖組。Westeron Blot 結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)NOX4、NLRP3 高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：2670188