【摘要】：腎細胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是較常見的癌癥,也是最致命的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。然而,它不是一個單一的實體,而是多種腫瘤的集合,被認為是腎小管幾個部分表型的再現(xiàn),每個部分都有不同的組織學和遺傳學特征。腎腫瘤與許多其他侵襲性或浸潤性腫瘤不同,呈舌狀微細延伸至腎靜脈或腎竇,通常無纖維增生性或破壞性浸潤反應。因此,與其他器官的癌癥相比,腎細胞癌較不易被發(fā)現(xiàn)。深入了解腎臟解剖,對組織進行充分取樣,并在大體檢查和顯微鏡分析中對這些重要發(fā)現(xiàn)進行預測和仔細研究是較為重要的。NPM1屬于組蛋白伴侶家族,核仁蛋白/核質蛋白(NPM)家族,包括多個主要功能成員(NPM1,NPM2,NPM3和無脊椎動物NPM),并且可以在所有多細胞動物中找到。雖然這個家族在功能上有很好的特征,但人們對這些基因和蛋白質的進化知之甚少。本研究旨在應用蛋白組學的方法研究腎透明細胞癌腫瘤組織與癌旁組織之間蛋白表達譜的差異,從而建立腎透明細胞癌的差異表達譜,目標是通過對部分蛋白的研究,進一步了解腎透明細胞癌發(fā)生發(fā)展的促進因子或抑制因子。我們從差異表達蛋白譜中選取NPM1作為目標蛋白,采用免疫印跡(Western Blot)的方法驗證了其表達情況;免疫組化分析不同分化程度的腎透明細胞癌中蛋白NPM1的表達情況;構建NPM1過表達和低表達的穩(wěn)轉細胞株,觀察RNA干擾NPM1基因的表達對腎透明細胞癌細胞786-O的增殖、侵襲及遷移的影響作用,從而進一步了解NPM1對腎透明細胞癌的影響。本研究共分為四部分第一部分:腎透明細胞癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜的建立方法:1、選取10例腎透明細胞癌腫瘤組織標本及配對的癌旁正常組織標本作為研究對象。所用癌旁組織均取自癌組織上端,且距離癌組織均大于5厘米。所有患者術前均未接受任何化療和放療,且腫瘤組織標本術后均經(jīng)病理學證實為腎透明細胞癌。術中切除的組織經(jīng)PBS沖洗放入液氮速凍,再置于-80℃冰箱保存。2、提取腫瘤組織和癌旁組織中的總蛋白,并分析組織的蛋白質濃度。3、制備蛋白水解多肽混合物。4、采用二維液相色譜法進行樣本的分離。5、通過LTQ XL離子阱質譜儀對二維色譜洗脫的多肽進行檢測。6、對質譜數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,找到癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白質。結果:1、經(jīng)二維色譜與質譜聯(lián)用分析,在腎透明細胞癌組織標本中共獲得了846個蛋白質點;癌旁組織中共獲得了535個蛋白質點。將這些蛋白質點進行比對,并經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織差異表達的蛋白質共有35個。2、在腫瘤組織中上調(diào)表達的20個蛋白質分別是:NPM1、AHNAK2、PDIA3、MCT4、Cyp A、SKP1、CA9、SCGN、KRT18、HAPLN2、TGM2、CPQ、ACY1、POSTN、PAH、FREM2、LAMA4、CSPG4、GBP1、RBP4。3、在腫瘤組織中下調(diào)表達的15個蛋白質分別是:C11ORF54、APOA4、SERPINA5、AGXT2、CHDH、NNT、ACE、ISCU、PRDX3、AK2、PNP、NPL、MRPL44、PHYH、GRHPR。4、通過本次研究我們建立了腎透明細胞癌組織和癌旁組織的差異表達蛋白譜,為進一步深入研究腎透明細胞癌的發(fā)病機制提供實驗數(shù)據(jù)。5、從差異表達蛋白譜中選取NPM1作為目標蛋白進行后續(xù)研究。第二部分:NPM1差異表達的驗證及其與相關臨床病理資料信息的關系分析方法:1.選取10例原發(fā)性腎透明細胞癌組織標本和10例配對癌旁組織標本,用Western-blot的方法鑒定目標蛋白NPM1在腎透明細胞癌組織及癌旁組織中的表達情況。2.收集100例不同分期的腎透明細胞癌患者的病切片,免疫組化法觀察蛋白NPM1的表達與患者分期的相關性。結果:1.在隨機選取的10組腎透明細胞癌組織標本中,對比分析目標蛋白NPM1分別在腎透明細胞癌腫瘤組織及其配對的癌旁組織中的表達量,我們發(fā)現(xiàn)蛋白NPM1在腎透明細胞癌組織中上調(diào)表達。2.通過統(tǒng)計學分析,認為NPM1蛋白的表達可以提示與腫瘤的TNM分期(p0.05)相關;然而NPM1蛋白的表達水平與患者性別、年齡無相關性(p0.05)。第三部分:NPM1在腎透明細胞癌細胞株中的表達及其過表達對細胞生物功能的影響方法:1、制備NPM1過表達及低表達穩(wěn)轉單克隆細胞株。2、在熒光顯微鏡下觀察質粒轉染的腎透明細胞癌細胞786-O、NPM1-shRNA質粒轉染的腎透明細胞癌細胞786-O內(nèi)NPM1蛋白的表達情況。3、Western-blot及RT-PCR驗證各組穩(wěn)轉細胞株中NPM1的基因水平及蛋白水平。4、觀察質粒轉染的腎透明細胞癌細胞786-O、NPM1-sh RNA質粒轉染的腎透明細胞癌細胞786-O增殖侵襲、遷移的影響。結果:1、我們成功構建了NPM1過表達和低表達的穩(wěn)轉細胞株。2、我們通過觀察腎透明細胞癌細胞786-O中,NPM1不同表達水平情況下細胞的生長能力,觀察NPM1對腎透明細胞癌細胞的生物學行為的影響。觀察細胞生長曲線,結果顯示:與control組相比,NPM1過表達時,腎透明細胞癌細胞786-O生長能力明顯增強(p0.05),而NPM1表達降低時,腎透明細胞癌細胞786-O生長能力明顯減弱(p0.05)。3、我們通過觀察腎透明細胞癌細胞786-O中,NPM1不同表達水平情況下細胞的遷移能力,觀察NPM1對腎透明細胞癌細胞的生物學行為的影響。細胞遷移的結果顯示:NPM1過表達時,腎透明細胞癌細胞786-O遷移能力明顯增強(p0.05),而NPM1表達降低時,腎透明細胞癌細胞786-O遷移能力明顯減弱(p0.05)4、我們通過觀察腎透明細胞癌細胞786-O中,NPM1不同表達水平情況下細胞的侵襲能力,觀察NPM1對腎透明細胞癌細胞的生物學行為的影響。NPM1過表達時,腎透明細胞癌細胞786-O侵襲能力明顯增強(p0.05),而NPM1表達降低時,腎透明細胞癌細胞786-O侵襲能力明顯減弱(p0.05)。第四部分:穩(wěn)轉細胞株在裸鼠中的成瘤情況方法:選取4周齡的SPF級裸鼠,將成功篩選的穩(wěn)轉細胞株經(jīng)皮下注入到裸鼠體內(nèi),30天后統(tǒng)一處死,取出瘤體,量取腫瘤的大小并稱重,Western-blot檢測瘤體中蛋白NPM1的表達水平,分析蛋白NPM1不同表達水平下的瘤體之間的差異性。結果:1、各組腎透明細胞癌細胞786-O接種后第9天,即可在裸鼠皮下觀察到腫瘤結節(jié),隨著時間的延長瘤體逐漸增大,觸之較硬,與周圍邊界清晰。2、稱重瘤體,結果顯示NPM1-overexpressed組裸鼠瘤體平均重量明顯高于control組(p0.05);NPM1-sh RNA組裸鼠瘤體平均重量明顯低于相應的control組(p0.05)。3.我們應用Western-blot檢測了裸鼠移植瘤組織內(nèi)NPM1蛋白的表達情況,結果顯示NPM1-overexpressed組中NPM1蛋白表達高于control組(p0.05);NPM1-sh RNA組NPM1蛋白表達明顯低于NC組(p0.05)。通過以上研究,我們得出以下結論:1.二維色譜-質譜聯(lián)用技術分析差異蛋白的結果,可用于對腫瘤中的差異蛋白的檢測。2.腎透明細胞癌組織中NPM1的表達量顯著高于癌旁組織;發(fā)現(xiàn)蛋白NPM1的表達與TNM分期相關。3.蛋白NPM1的表達對腎透明細胞癌細胞的增殖、侵襲與遷移均有促進作用。4.通過體內(nèi)裸鼠成瘤實驗,驗證了體外實驗中觀察到的蛋白NPM1對腫瘤的增殖的促進作用。
【圖文】：

核仁磷酸蛋白（Recombinant Nucleophosmin, NPM1），也稱為B23，No38或Numatrin，是在增殖性較強細胞的細胞核中發(fā)現(xiàn)的豐富的核仁蛋白。NPM1已被證明參與核糖體生物起源、mRNA加工、染色質重塑和胚胎形成（圖1.1）。雖然人們對NPM1在代謝途徑中的功能了解很多，但很明顯NPM1還通過在各種DNA修復途徑中起作用并調(diào)節(jié)細胞凋亡而具有維持基因組穩(wěn)定性的關鍵功能。在本綜述中，我們闡述了上述功能的最新概述，特別是NPM1在DNA修復中的作用的最新數(shù)據(jù)，NPM1功能障礙如何導致癌癥病變。圖1.1 細胞內(nèi)NPM1功能概述NPM1通過與組蛋白和其他染色質重塑蛋白結合，參與人類生物過程，，如DNA修復，胚胎形成，可能通過與染色質相互作用。 重要的是，NPM1還促進核糖體的形成

由12個外顯子組成，編碼至少兩個亞型(圖1.2a)[1]。NPM1.1(或B23.1)與全長轉錄物對應，故而在所有組織中有294個氨基酸蛋白(35-40kda)的大量表達。另外,NPM1.3(也稱為B23.2)擁有不同的3′外顯子，并編碼在細胞中以低水平表達的蛋白質，缺少NPM1 C末端的最后35個氨基酸[2]。NPM1.2的第三種亞型已經(jīng)被提出，但是到目前為止，沒有生物學數(shù)據(jù)支持這一發(fā)現(xiàn)[3]。NPM1屬于組蛋白伴侶家族，核仁蛋白/核質蛋白（NPM）家族，包括多個主要功能成員（NPM1，NPM2，NPM3）
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.11

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本文編號：2662147