【摘要】：研究背景和目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴(yán)重、最常見的微血管并發(fā)癥之一。腎臟纖維化是DN的主要病理結(jié)局,也是晚期腎病(ESRD)的主要病因。DN的病理變化主要包括正常腎單位的丟失、大量成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)如膠原蛋白和纖連蛋白(FN)過量生成并堆積以及腎小球內(nèi)Kimmelsstiel-Wilson(KW)結(jié)節(jié)形成,并且伴隨著腎小球與腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致腎小球硬化。目前防治DN的措施主要包括控制血糖、血壓和血脂等,但目前臨床和基礎(chǔ)研究階段的藥物只能延緩而不能阻止DN的進(jìn)展,且大都具有較嚴(yán)重的副作用。因此,尋找有效防治DN的方法與藥物具有重要的理論與實踐意義。植物來源的生物活性肽由于其潛在的營養(yǎng)和藥用價值被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域,目前發(fā)現(xiàn)的這類多肽有降膽固醇肽、血管緊張素I抑制肽、抗菌肽、免疫調(diào)節(jié)肽和抗氧化肽等,但這類多肽目前還未應(yīng)用于抗腎臟纖維化研究。鑒于氧化應(yīng)激在DN中的重要作用,我們選擇了具有抗氧化作用的多肽RAP(序列為YWDHNNPQIR),研究其在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型和高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞(GMC)中的抗纖維化作用。方法:(1)體內(nèi)實驗:8周齡雄性C57BL/6小鼠連續(xù)5天腹腔注射STZ45mg/kg/day,正常組注射相同體積的檸檬酸緩沖液,平衡72h后檢測血糖,血糖值大于11.1m M認(rèn)定為糖尿病模型成功,然后將小鼠隨機(jī)分成正常對照組(normal control group,Control,n=6)、糖尿病模型組(diabetic model group,DM,n=8)、RAP低劑量組(RAP low dose group,0.1 mg/kg,RAP-L,n=8)和RAP高劑量組(RAP high dose group,0.1 mg/kg,RAP-H,n=8),進(jìn)行隔天皮下注射給藥,其中正常組給予相同體積的PBS溶液,并同時給予糖尿病模型組和給藥組高脂高糖飼料(HFD)喂養(yǎng)12周。實驗結(jié)束前用代謝籠收集尿液檢測尿蛋白,取血后檢測血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)和血清TGF-?1水平。解剖收集腎臟后通過六胺銀基底膜(PASM)、HE、Masson和天狼星紅(Sirius Red)染色進(jìn)行病理學(xué)檢測,同時用Western Blot、RT-PCR和免疫組化實驗檢測小鼠腎臟中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的mRNA水平和蛋白水平表達(dá),還檢測了小鼠腎臟中ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。(2)體外實驗:高糖誘導(dǎo)GMC細(xì)胞后用MTT實驗檢測RAP對細(xì)胞增殖的影響和毒性作用,確定RAP的最佳濃度為50?M和100?Μ。同時,在mRNA水平和蛋白水平,檢測高糖誘導(dǎo)GMC細(xì)胞中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的表達(dá)情況,及ERK1/2、p38和p65的磷酸化水平。此外,用ELISA實驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中胞外基質(zhì)FN和COL4的含量。結(jié)果:(1)與糖尿病組相比,RAP能夠改善DN腎臟纖維化癥狀,包括改善BUN、Scr和TG等腎臟指標(biāo),改善氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和MDA,抑制腎臟中TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA的表達(dá)量,減輕腎臟中膠原纖維沉積,改善腎小球肥大及基底膜增厚現(xiàn)象,同時能夠抑制腎臟MAPK和NF-?B信號通路。(2)RAP能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)下GMC細(xì)胞培養(yǎng)液中FN和COL4的表達(dá),同時能夠下調(diào)TGF-?1、CTGF、FN和?-SMA在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。此外,RAP抑制GMC細(xì)胞中MAPK和NF-?B信號通路。結(jié)論:多肽RAP能夠通過抑制MAPK和NF-?B信號通路來改善STZ誘導(dǎo)的DN腎臟纖維化和高糖誘導(dǎo)的GMC細(xì)胞纖維化作用。
【圖文】：

是 ECM 沉積導(dǎo)致腎臟纖維化的主要刺激因子。1.1.2.2 結(jié)締組織生長因子結(jié)締組織生長因子（CTGF/CCN2）是一種多域的母細(xì)胞蛋白，它在不同的組織中起到調(diào)節(jié)原纖維的作用。高葡萄糖、氧化應(yīng)激和 AngII 等外界刺激能夠使體內(nèi) TGF- 1 表達(dá)量增加，，從而誘導(dǎo) CTGF 活化，進(jìn)一步誘導(dǎo)其下游的纖維化作用。雖然 CTGF 的具體靶細(xì)胞目前尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn) CTGF 能夠激活 Smad、ERK和 Wnt 等信號通路13,14。在腎臟中，CTGF 能夠通過裂解成很小的碎片來激活基質(zhì)細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞。Guha 等人在 1 型和 2 型糖尿病小鼠模型中研究了CTGF 的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型腎臟中，CTGF 表達(dá)量顯著增加，并且在單側(cè)輸尿管阻塞模型（UUO）中，CTGF 反義寡核苷酸能夠抑制腎臟纖維化程度15。Yokoi 等人發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因的糖尿病模型中，CTGF 的表達(dá)量也顯著增加，與此同時，小鼠 24h 尿蛋白含量增加、腎小球基底膜增厚、ECM 大量沉積16。Mason等人的研究發(fā)現(xiàn)，CTGF 還能夠與細(xì)胞表面的 整合素結(jié)合，激活 p42/p44 絲裂原活化蛋白激酶，從而導(dǎo)致系膜細(xì)胞中 FN 和 COL4 等 ECM 蛋白大量積聚，而用 整合素抗體處理后，又能夠顯著抑制 ECM 蛋白的合成17。

圖 1-2 DN 相關(guān)信號通路之間相互作用圖301.1.3.1 TGF- /Smad 信號通路Smad 蛋白是 TGF- 1 受體的胞內(nèi)激酶底物，也是目前被唯一證實的介導(dǎo)TGF- 1 在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的物質(zhì)，主要有 TGF- 1 受體 I（TbR I）和 TGF- 1 受體 II（TbR II）2 種受體。TGF- 1 受體 II（TbR II）與 TGF- 1 結(jié)合后刺激 TGF- 1 受體 I（TbR I）激酶，導(dǎo)致 Smad2 和 Smad3 磷酸化，磷酸化的 Smad2 和 Smad3能夠與正常的 Smad4 聚合，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號通路31。Smad2、Smad3 和 Smad4的聚合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中調(diào)控目標(biāo)基因 Smad7的轉(zhuǎn)錄，Smad7是Smad2 和Smad3的抑制物，它通過靶向與 TbR I 結(jié)合來抑制 Smad2/Smad3 的活化32。在哺乳動物體內(nèi)，Smad2 和 Smad3 是纖維化因子 TGF- 1 的特異性受體，而 Smad1、Smad5和 Smad8 是骨形態(tài)蛋白（BMP）的特異性受體。除了依賴于 Smad 的途徑之外，TGF- 1 還通過與非 Smad 途徑作用來發(fā)揮其生物作用，如有絲分裂蛋白激活蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇 3 激酶和 Rho 激酶途徑等33。研究發(fā)現(xiàn)，TGF- /Smad信號通路在 1 型和 2 型 DN 病人中被高度激活，即腎小球和腎小管細(xì)胞中 Smad2
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 蘭洋,周欽,吳兆龍;NF-κB involved in transcription enhancement of TGF-β1 induced by Ox-LDL in rat mesangial cells[J];Chinese Medical Journal;2004年02期

本文編號：2662108