【摘要】：研究背景自1982年,Moorhead等首次提出“脂質(zhì)腎毒性”假說,脂質(zhì)與腎臟損傷的關(guān)系逐漸得到重視。一方面,脂質(zhì)異常是導(dǎo)致腎臟損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另一方面,脂質(zhì)異�？杉又芈阅I臟病(chronic kidney disease,CKD)的進(jìn)展。目前由于糖尿病(diabetes mellitus,DM)、肥胖等代謝性疾病的患病率快速增加,脂質(zhì)代謝異常與腎臟損傷之間的惡性循環(huán)不可小覷。探索由脂質(zhì)誘導(dǎo)的腎臟損害的具體機(jī)制可為脂質(zhì)相關(guān)腎病的防治提供新方向。傳統(tǒng)認(rèn)為類似于動(dòng)脈粥樣硬化,高血脂主要通過誘導(dǎo)腎血管內(nèi)皮粥樣斑塊形成引起腎損傷,但脂質(zhì)對(duì)腎臟的影響遠(yuǎn)不止于此。如在局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者的病理切片中可發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、脂滴形成及細(xì)胞泡沫樣化。脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)受損可造成脂質(zhì)在足細(xì)胞內(nèi)過度積聚,誘發(fā)足細(xì)胞損傷,促進(jìn)腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展。清道夫受體A(scavengerreceptorA，SR-A)是細(xì)胞表面識(shí)別和攝取氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow-density lipoprotein,ox-LDL)的重要受體。在高脂條件刺激下,SR-A表達(dá)持續(xù)增加致脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)無限積聚,是介導(dǎo)脂質(zhì)腎臟損傷的關(guān)鍵分子,然而SR-A逃逸細(xì)胞內(nèi)膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不明確。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的首個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌因子,參與腫瘤發(fā)生、能量代謝等過程。我們既往體外研究表明在ox-LDL刺激下,敲除PTEN可使SR-A表達(dá)上調(diào),細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加,足細(xì)胞損傷加重;相反,過表達(dá)PTEN可顯示相反的效果。但PTEN調(diào)節(jié)SR-A表達(dá)的機(jī)制尚不明確。綜上述,本研究擬進(jìn)一步在體內(nèi)觀察足細(xì)胞特異性敲進(jìn)PTEN在高脂飲食(high fat diet，HFD)條件下對(duì)小鼠腎臟的作用,并初步探討足細(xì)胞內(nèi)PTEN調(diào)控SR-A介導(dǎo)脂質(zhì)攝取的具體機(jī)制。研究方法(一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建足細(xì)胞特異性PTEN敲進(jìn)(podocyte-specific PTEN knock-in,PPKI)轉(zhuǎn)基因小鼠，HFD誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠腎損傷。分為正常飲食(normal diet,ND)+ 對(duì)照(Ctrl)組、ND + PPKI 組、HFD + Ctrl 組、HFD + PPKI 組。于飲食干預(yù)后第24周,免疫熒光法觀察足細(xì)胞內(nèi)PTEN、SR-A的表達(dá)情況;檢測(cè)4組小鼠臨床生化指標(biāo),包括體重、腎臟指數(shù)、血糖、血脂、血肌酐、尿白蛋白排泄(尿白蛋白與肌酐比);油紅O染色和腎皮質(zhì)膽固醇定量觀察腎脂質(zhì)積聚情況;PAS染色觀察腎小球系膜基質(zhì)增生情況,電鏡觀察腎小球足突融合、基底膜厚度,蛋白印跡檢測(cè)腎組織中纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、膠原蛋白Ⅳ(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達(dá),以評(píng)估腎小球硬化情況。(二)體外實(shí)驗(yàn):以ox-LDL刺激的足細(xì)胞作脂質(zhì)腎損傷模型。本研究將分化成熟的足細(xì)胞分為:1)正常對(duì)照組(control組);2)ox-LDL組;3)si-YAP +ox-LDL 組;4)ad-PTEN + ox-LDL 組;5)si-PTEN + ox-LDL 組;6)Bpv + ox-LDL組。免疫熒光和蛋白印跡檢測(cè)PTEN、SR-A及Hippo-YAP信號(hào)通路的活性和表達(dá)。免疫共沉淀觀察PTEN與YAP之間的相互作用。結(jié)果(一)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與ND +Ctrl組相比,HFD +Ctrl組小鼠的體重、腎臟指數(shù)、血脂、血肌酐、尿白蛋白排泄水平上升,足細(xì)胞SR-A表達(dá)及腎內(nèi)脂質(zhì)含量明顯增加,腎小球明顯纖維化硬化(均P0.05);相反,與HFD +Ctrl組相比,HFD + PPKI組小鼠腎臟指數(shù)、血肌酐、尿白蛋白排泄水平降低,足細(xì)胞SR-A表達(dá)及腎內(nèi)脂質(zhì)含量明顯減少,系膜基質(zhì)增生、足突融合及基底膜增厚程度減輕,腎組織纖維化蛋白表達(dá)下降(均P0.05)。(二)體外實(shí)驗(yàn):1)ox-LDL刺激能上調(diào)足細(xì)胞SR-A表達(dá),與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);敲除YAP可使ox-LDL誘導(dǎo)的SR-A表達(dá)下調(diào)(P0.05)。2)在ox-LDL刺激下足細(xì)胞內(nèi)P-YAP水平增高,與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);上調(diào)PTEN的表達(dá)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的P-YAP水平上調(diào)(P0.05);而ox-LDL刺激下敲除PTEN或抑制PTEN磷酸酶活性均能進(jìn)一步上調(diào)P-YAP的水平(均P0.05);但總YAP及Hippo-YAP通路的其他分子均無明顯改變。結(jié)論高脂飲食條件下足細(xì)胞特異性過表達(dá)PTEN對(duì)腎臟有保護(hù)作用,且PTEN可能通過使P-YAP去磷酸化進(jìn)而抑制SR-A介導(dǎo)的脂質(zhì)攝取從而拮抗脂質(zhì)腎損傷。
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石頁士學(xué)位論文逡逑（２）用說0／線性化Ｒｏｓａ－Ｐｔｅｎ質(zhì)粒ＤＮＡ，經(jīng)電穿孔進(jìn)入ＥＳ細(xì)胞重組。ＰY沖義匣潁遙錚螅幔玻段壞悖耄睿錚悖耄椋钚∈蟠虬性靨騫菇ú唄約跡保�。辶x希五澹梗梗耄忮五危卞義希巍鰣邋五五濉鰣澹濉鰣澹咤�！邋＿邋■■■■埩x希危苠危遙錚螅幔玻跺澹紓澹睿邋澹歟錚悖殄義希保埃福罰猓皰濉澹危誨五澹矗玻擔(dān)梗猓皰邋五澹苠義希簦幔潁紓澹簦椋睿玨澹觶澹悖簦錚蟈義希卞澹插澹沖義希簦幔潁紓澹簦澹溴澹紓澹睿邋澹歟錚悖殄義稀鰣濉觶懾危懼巍觥觶繛靛義希澹錚鑠澹ǎ悖錚洌椋睿玨澹潁澹紓椋錚睿╁澹ǎ睿錚睿悖錚洌椋睿玨澹潁澹紓椋錚睿╁危校牽耍睿澹錚攏穡剩觶掊危模裕鈴義賢跡保玻澹校簦錚炕潁耄睿錚悖耄椋畹拇虬脅唄藻義希疲椋紓酰潁邋澹保玻澹校簦澹鑠澹紓澹睿邋澹耄睿錚悖耄椋鑠澹螅簦潁幔簦澹紓義希玻┩粗刈椋牛酉赴ㄥ義希ǎ保┯冒，

本文編號(hào)：2659221