發(fā)布時間：2020-05-09 18:22

【摘要】：研究背景:慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一種嚴重威脅人類健康的全球性疾病,且近年來發(fā)病率有逐年增高的趨勢。據(jù)統(tǒng)計,在我國終末期腎病(end stage renal diseases,ESRD)的患者約有十余萬人之多,已經(jīng)成為一個嚴重的社會問題。成人腎臟具有一定數(shù)量的腎單位,一旦受損很難再生。然而目前對于終末期腎病并沒有理想有效的治療方式,現(xiàn)今的治療主要有兩種:透析和腎臟移植。透析治療嚴重影響著患者的生活質(zhì)量,并且使患者家庭承擔(dān)了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。且長時間的透析會產(chǎn)生心血管疾病、骨病等多種并發(fā)癥。腎臟移植是當(dāng)前治療ESRD最有效的治療方法,但是供體短缺及嚴重的免疫排斥反應(yīng)很大程度上限制了其廣泛應(yīng)用。因此,對于臨床醫(yī)生來說迫切地需要尋找一種新的治療ESRD措施。腎臟再生的目的在于在建立一個具備完整腎臟結(jié)構(gòu)和功能的人工腎臟,目前腎臟再生的策略主要有六種:囊胚互補,體外誘導(dǎo)腎臟類器官,后腎移植,成體腎臟干細胞,生物人工腎(bioartificial kidney,BAK)和脫細胞腎支架(decellularized kidney scaffold,DKS)。囊胚互補是指在sall1基因缺失的小鼠囊胚內(nèi)通過顯微注射外源性干細胞,使干細胞與囊胚共同發(fā)育并形成嵌合體,進而獲得外源性干細胞來源的腎臟,該方法的優(yōu)點在于細胞來源可自主選擇并且可獲得完整腎臟,但是由于外源干細胞和囊胚所產(chǎn)生的嵌合體存在嚴重的倫理問題,因此并不能成為理想的腎臟再生方法。腎臟類器官研究,干細胞是一種能夠向各種細胞類型分化的細胞類型,通過向培養(yǎng)基中添加生長因子可以體外誘導(dǎo)多能干細胞向腎系分化,而后通過3D培養(yǎng)可以獲得具有立體結(jié)構(gòu)的腎臟類器官,期望通過細胞的自我組裝成為組織器官。其缺點是缺乏血管供應(yīng),且分化效率較低。后腎移植是通過解剖獲取胚胎期的后腎組織移植到腎衰動物體內(nèi),可以一定程度上緩解腎衰程度,后腎細胞處于腎臟前體細胞或腎臟祖細胞發(fā)育階段,因此具有較高的多能性,并且免疫原性較低,但是因為需要使用胚胎腎臟進行移植,同樣存在倫理問題,限制了臨床應(yīng)用。腎臟干細胞是成體干細胞中研究最晚的一類干細胞,理論上腎乳頭為腎臟干細胞的壁龕,通過分離腎臟干細胞并在體外培養(yǎng),可在培養(yǎng)分化出腎臟細胞,用于腎臟再生研究。但是目前對于腎臟干細胞的研究主要集中在發(fā)育中的胚胎腎。研究表明,腎臟干細胞來源于輸尿管芽誘導(dǎo)的后腎間質(zhì),但當(dāng)前對腎臟成體干細胞的分離技術(shù)尚不成熟,還有待深入研究。生物人工腎是將工程科學(xué)技術(shù)與再生醫(yī)學(xué)相結(jié)合的裝置,用以起到替代腎臟功能的作用,該技術(shù)能夠一定程度上維持尿毒癥患者在腎功能衰竭狀態(tài)下的生存。干細胞結(jié)合腎臟脫細胞支架構(gòu)建組織工程腎臟是一種實現(xiàn)腎臟再生的新方法,有望能夠起到腎臟替代治療的作用,因此成為近年來再生醫(yī)學(xué)研究的熱點課題之一。腎臟脫細胞支架技術(shù)是指將動物成體的腎臟組織經(jīng)化學(xué)和物理方法去除原本腎臟中的自體細胞,剩余無免疫原性或低免疫源性的細胞外基質(zhì),將其作為生物材料用于構(gòu)建組織工程支架,而后使用成體細胞或者干細胞灌注脫細胞支架使之再細胞化,經(jīng)過一段時間的共培養(yǎng)獲得具有一定功能的組織工程腎臟。脫細胞支架由于原本的供體細胞被洗脫因而免疫源性大大降低,并且保留了正常腎臟的結(jié)構(gòu)和細胞外因子,有利于種子細胞在支架內(nèi)的生長和分化。對于種子細胞的選擇,正常腎臟中細胞種類較為復(fù)雜,難以選擇一種或者幾種成體細胞進行腎臟再生。近年來對干細胞的研究日益深入,干細胞具有多向分化且無限增殖的特性,能夠在不同的環(huán)境條件下向不同的細胞類型分化,因此是一類比較理想的種子細胞類型。先前的研究中曾利用胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESCs)、臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、大鼠后腎間質(zhì)細胞等結(jié)合脫細胞支架進行腎臟再生研究,但是上述細胞均存在倫理問題而不能進一步應(yīng)用于臨床。脂肪干細胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)是一種易于獲取、容易培養(yǎng)并且具有多項分化潛能的干細胞類型。脂肪干細胞來源于中胚層,在特異性生長因子和環(huán)境的影響下可以跨越胚層分化。間介中胚層(Intermediate mesoderm,IM)是中胚層階段的一部分,其主要的分化方向為腎臟和性腺,是腎實質(zhì)結(jié)構(gòu)的來源。研究目的:本實驗擬采用脂肪干細胞在體外環(huán)境下通過添加誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)其分化為間介中胚層細胞,之后用于對腎臟脫細胞支架的再細胞化,從而構(gòu)建有腎臟結(jié)構(gòu)和部分功能的組織工程腎臟。研究方法:1.分離、培養(yǎng)原代ADSCs:取大鼠腹股溝脂肪墊脂肪,經(jīng)過消化離心等步驟獲取原代脂肪干細胞,傳至第四代用于后續(xù)實驗,通過光鏡觀察細胞形態(tài),誘導(dǎo)成脂分化,14天后進行油紅O染色,成骨分化21天后進行茜素紅染色,成軟骨分化21天后進行阿利新藍染色,鑒定其成脂、成骨、成軟骨特性。利用流式細胞儀檢測CD29,CD34,CD45,CD90,CD105的表達情況。2.誘導(dǎo)ADSCs向間介中胚層細胞分化:在不同時間節(jié)點依次向ADSCs培養(yǎng)基中加入CHIR99021和FGF9因子,誘導(dǎo)作用7天后獲得間介中胚層細胞。通過光學(xué)顯微鏡對比誘導(dǎo)前后細胞形態(tài)變化,利用免疫熒光鑒定間介中胚層特異性標(biāo)志物OSR1,PAX2的表達情況。Western blot重復(fù)驗證OSR1,PAX2的表達,同時以小鼠9.5天胚胎體節(jié)后部組織作為陽性對照。3.脫細胞支架的制備:選取體重約250g的wistar大鼠,使用10%水合氯醛麻醉。之后做腹部正中切口并暴露腹主動脈,通過24G套管針灌注無菌PBS水沖出腎臟內(nèi)血液,摘除腎臟后分別通過腎動脈和輸尿管留置24G和26G套管針。應(yīng)用0.5%十二烷基硫磺酸鈉(Sodium-dodecyl sulphate,SDS)持續(xù)灌注腎臟,洗脫腎臟細胞6小時,再使用無菌PBS沖洗殘留SDS后獲得可用于后續(xù)實驗的脫細胞支架。4.對比脫細胞前后的變化:通過HE染色對比正常腎臟和脫細胞支架的形態(tài)結(jié)構(gòu),masson染色觀察正常腎臟和脫細胞支架中膠原的表達情況,通過電鏡對比腎臟組織和支架的亞顯微結(jié)構(gòu)的差異。5.對腎臟組織和脫細胞支架中DNA含量,膠原含量和細胞因子的測定:應(yīng)用DNA和膠原測定試劑盒檢測腎臟組織和脫細胞支架中的DNA和膠原的含量,通過ELISA檢測對比腎組織和支架中HGF,VEGF,TGF-β的含量差異,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。6.脫細胞支架再細胞化:將誘導(dǎo)后獲取的IM細胞由腎動脈和輸尿管端注入,灌注培養(yǎng)基,持續(xù)供氧,共培養(yǎng)10天后收獲再細胞化的腎臟,通過HE染色觀察支架內(nèi)細胞貼附情況,利用免疫熒光鑒定腎小管標(biāo)志物E-CAD,GATA3,足細胞標(biāo)志物WT1的表達情況。同時將ADSCs灌注支架,單純體外培養(yǎng)的ADSCs和IM細胞作為對照進行熒光染色。研究結(jié)果:1.光學(xué)顯微鏡下觀察ADSCs的形態(tài)為長梭形,成脂分化14天進行后油紅O染色,可見紅色脂滴的產(chǎn)生;成骨分化21天后進行茜素紅染色,可見骨化結(jié)節(jié)著色;成軟骨分化21天后進行阿利新藍染色,觀察到軟骨球被染成藍色。進行流式細胞鑒定CD29,CD34,CD45,CD90,CD105的表達情況,陽性率分別為99.9%,1.1%,2.4%,100%和97.2%,符合ADSCs的表型。2.經(jīng)過7天的間介中胚層誘導(dǎo)分化,可以觀察到細胞產(chǎn)生形態(tài)變化。免疫熒光觀察OSR1和PAX2的表達在IM細胞中明顯高于ADSCs。Western blot可見OSR1和PAX的陽性表達。3.經(jīng)過6小時的0.5%SDS脫細胞處理,通過肉眼觀察腎臟逐漸變?yōu)橥该鳂?表明支架內(nèi)細胞被從原先腎臟結(jié)構(gòu)上洗脫完全。4.通過HE染色對比脫細胞支架和正常腎臟組織可以發(fā)現(xiàn),脫細胞支架內(nèi)沒有細胞存留,表明脫細胞完全。masson染色觀察發(fā)現(xiàn)脫細胞過程膠原被完整的保留。掃描電鏡觀察脫細胞支架微結(jié)構(gòu)與正常腎臟組織相比沒有明顯破壞。5.DNA測定脫細胞支架中DNA低于正常含量的5%以下;膠原含量與正常組沒有明顯差異;HGF,VEGF,TGF-β與正常組相比亦無明顯改變。6.HE染色觀察ADSCs通過動脈、輸尿管結(jié)合脫細胞支架可以觀察到細胞分布于血管、腎小球、腎小管等部位;IM結(jié)合脫細胞支架觀察到同樣的結(jié)果。免疫熒光鑒定細胞的分化情況觀察E-CAD,GATA3,WT1的表達,可以發(fā)現(xiàn)IM在支架中上述標(biāo)志物的陽性率較ADSCs結(jié)合支架組高,且單純體外培養(yǎng)ADSCs和IM沒有觀察到上述標(biāo)志物的表達。研究結(jié)論:間介中胚層細胞結(jié)合腎臟脫細胞支架后較未經(jīng)誘導(dǎo)的干細胞結(jié)合支架有更高的分化效率。間介中胚層細胞在支架內(nèi)可以觀察到足細胞樣和腎小管樣細胞的表達。由此說明體外誘導(dǎo)干細胞產(chǎn)生進一步分化后再結(jié)合腎臟脫細胞支架是一種可行的腎臟再生策略。同時,腎臟脫細胞支架可以作為一種良好的生物材料用于腎臟再生研究。
【圖文】：

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圖５．脫細胞前后的對比
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2656544