【摘要】：目的:比較健康人尿源性干細胞(Urine derived stem cell,USC)與糖尿病腎病患者尿源性干細胞(USC from patients with diabeticnephropathy,D-USC)生物學特性的差異,并探討采取低氧(3%O_2)預(yù)處理后對兩種細胞增殖、分泌和凋亡的影響,評估低氧預(yù)處理尿源性干細胞在糖尿病腎病腎組織修復(fù)中的作用。方法:收集10名年齡20-25歲之間健康男性和10名男性糖尿病腎病患者尿液樣本,分離、培養(yǎng)USC和D-USC,通過觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物,茜素紅及油紅O染色分別檢測成骨和成脂分化潛能,鑒定其干細胞特性;繪制生長曲線比較USC與D-USC增殖能力,人促血管生成因子檢測試劑盒檢測細胞外分泌因子的表達情況,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,透射電鏡以及蛋白免疫印跡法檢測自噬水平的差異;低氧處理后檢測其增值、分泌、凋亡和自噬水平的變化。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)下建立SD大鼠糖尿病模型,每兩周通過尾靜脈分別注射USC和低氧預(yù)處理尿源性干細胞(Hypoxia-preconditioned urine-derived stem cell,HP-USC),共3次,最后一次注射六周后取材,電鏡及組織學檢測觀察腎臟病理變化。結(jié)果:原代培養(yǎng)約第5-6天可觀察到單個、“米粒樣”USC和D-USC克隆形成,此類細胞可以在體外分離培養(yǎng),連續(xù)傳代生長,細胞形態(tài)保持米粒狀,表達間充質(zhì)干細胞標志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105),周細胞標志物(CD 146),不表達造血干細胞標志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潛能;與USC相比,D-USC的增殖能力受到損傷,分泌因子種類基本保持一致,但數(shù)量上有所減少,細胞凋亡率升高,自噬水平較高;同常氧培養(yǎng)條件相比,USC和D-USC在低氧條件下能獲得明顯更多的細胞克隆,且其增值能力,旁分泌功能等明顯優(yōu)于常氧條件下的USC和D-USC,而凋亡現(xiàn)象減少,自噬水平降低。電鏡和組織學檢測提示USC和HP-USC治療組老鼠腎小球損傷及炎癥和纖維化程度都低于造模組,且低氧組效果相對于常氧組更好。結(jié)論:(1)成功從糖尿病腎病患者尿液中提取出尿源性干細胞,與USC特性一致,但增殖和分泌能力受損,凋亡增多,自噬水平較高;(2)3%O2低氧條件培養(yǎng),能夠提高USC和D-USC增殖、分泌功能,而抑制其凋亡的發(fā)生,降低細胞內(nèi)自噬水平;(3)低氧預(yù)處理能增強USC在糖尿病腎病進展中的作用,更好地修復(fù)腎損害。
【圖文】：

圖 1.1 不同代 USC 和 D-USC 的細胞形態(tài)Fig.1.1 Morphology of USC and D-USC at different passages2.2 USC 和 D-USC 細胞表面標志物的表達采用流式細胞術(shù)檢測了 USC 和 D-USC 細胞表面標志物的表達情況。結(jié)果顯示，兩種細胞都表達間充質(zhì)干細胞表面標志物 CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105，USC 陽性率分別為 98.6%、99.9%、61.5%、77.6%、1.65%，D-USC 陽性率分別為 92.0%、99.6%、88.6%、36.1%、1.39%。兩種細胞都表達周細胞表面標志 CD 146，USC 陽性率為 98.5%，D-USC 陽性率為 76.8%。兩種細胞都不表達造血細胞的表面標志 CD 31、CD 34 和 CD 45(圖 1.2)。該結(jié)果表明，從病人尿液中分離提取的細胞比較符合間充質(zhì)干細胞的特點，，與 USC 表達的表面標志物沒有明顯差異。

19圖 1.2 細胞表面標志物的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.1.2 Surface markers in cells analyzed by flow cytometry2.3 USC 和 D-USC 成骨與成脂誘導(dǎo)觀察細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細胞形態(tài)在第 4 天發(fā)生變化，呈方型，第 8 天時變化明顯，呈鵝卵石樣，第 21 天細胞變?yōu)槎嘟菭�，間質(zhì)內(nèi)大量礦鹽沉積形成鈣化結(jié)節(jié)。第 21 天時用 4%多聚甲醛固定細胞，經(jīng) 0.1%茜素紅染色后，可見明顯的紅色結(jié)節(jié)，
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：2650128