發(fā)布時(shí)間：2020-05-02 17:29

【摘要】：目的:探討高糖培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2微小RNA-148b(miRNA-148b)對(duì)其靶基因AMPKα的表達(dá)變化,miRNA-148b表達(dá)變化對(duì)線粒體裂變蛋白DRP1及線粒體形態(tài),線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c向胞質(zhì)釋放變化,細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生情況及細(xì)胞凋亡情況的影響,探討高糖誘導(dǎo)腎小管損傷的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn).方法:體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2,細(xì)胞同步化后按如下分組:(1)分為正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30.0 mmo/L葡萄糖)繼續(xù)觀察培養(yǎng)48h后,采用RT-PCR方法檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)miRNA-148b的表達(dá)變化。(2)轉(zhuǎn)染miR-148b inhibitor抑制miR-148b表達(dá)。分為正常糖組、高糖組、陰性對(duì)照高糖組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+30.0 mmo/L葡萄糖)和轉(zhuǎn)染miR-148b inhibitor高糖組(轉(zhuǎn)染miR-148b inhibitor+30.0 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)48h,采用MitoTracker熒光染料在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)線立體形態(tài)變化;采用DCFH-DA熒光探針熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞活性氧產(chǎn)生情況;western blot技術(shù)用于檢測(cè)AMPKα蛋白、DRP1蛋白、Cytochrome c蛋白、cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)變化;采用Annexin v/FITC熒光染料在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:(1)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞48h,與正常糖組相比,高糖組miR-148b表達(dá)顯著增高(p0.01)(2)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞48h,與正常糖組相比,高糖組AMPKα蛋白的表達(dá)下調(diào),抑制高糖狀態(tài)下miR-148b的表達(dá)后,與高糖組相比,AMPKα的表達(dá)有所上調(diào),(p0.05)但仍低于正常糖組。(3)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)48h,與正常糖組相比,高糖組線粒體裂變相關(guān)蛋白DRP1表達(dá)增多(p0.05),抑制高糖狀態(tài)下miR-148b的表達(dá)后,與高糖組相比,線粒體裂變相關(guān)蛋白DRP1表達(dá)減少。(4)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)48h,與正常糖組相比,高糖組細(xì)胞線粒體過(guò)度分裂,呈短棒狀或點(diǎn)狀,抑制高糖狀態(tài)下miR-148b的表達(dá)后,線粒體的過(guò)度分裂被抑制,更多的恢復(fù)為線狀和網(wǎng)狀。(5)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞48h,與正常糖組相比,高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多,細(xì)胞色素C向胞質(zhì)中釋放增多,抑制高糖狀態(tài)下miR-148b的表達(dá)后,與高糖組相比,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生較減少,細(xì)胞色素C向胞質(zhì)的釋放減少。(6)干預(yù)刺激腎小管上皮細(xì)胞48h,與正常糖組相比,高糖組腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3表達(dá)增加(p0.05),凋亡率增高;抑制高糖狀態(tài)下miR-148b的表達(dá)后,與高糖組相比,腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3表達(dá)減少,(p0.05)凋亡率減低(p0.05),。結(jié)論:(1)體外高糖條件下培養(yǎng)的人上小管上皮細(xì)胞miRNA-148b表達(dá)與正常糖組相比顯著上調(diào)。(2)高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞miRNA-148b的過(guò)表達(dá),下調(diào)靶蛋白AMPKα的表達(dá),線粒體分裂相關(guān)蛋白DRP1上調(diào),促進(jìn)線粒體分裂,ROS過(guò)度產(chǎn)生,細(xì)胞色素C釋放,細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染miRNA-148b inhibitor后可以上調(diào)靶基因AMPKα的表達(dá),抑制線粒體分裂,抑制高糖狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激亢進(jìn)和凋亡,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,是治療糖尿病腎病新的潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次，以3 結(jié)果促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)胞中 miR-148件下體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞中 miRNmol/L）、高糖（30mmol/L）的條件下體外培e PCR 技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞中 miRNA-148b 的表組 miRNA-148b 的表達(dá)明顯升高。如圖 1

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文使用 TargetScan 和 microRNA 計(jì)算軟件預(yù)測(cè) miR-148b 的靶基因?yàn)?AMP 2，為驗(yàn)證 miR-148b 是否可以靶向調(diào)控高糖組中 AMPKαl 的表達(dá)，我們 miR-148b 的 inhibitor 檢測(cè) AMPKα的表達(dá)變化。Western Blot 檢測(cè) AMP表達(dá)。結(jié)果顯示與正常糖組相比，高糖組 AMPKα的表達(dá)顯著下調(diào)，表明了蛋白 AMPKα的表達(dá)下調(diào)。與高糖組相比，，陰性高糖對(duì)照組 AMPKα的計(jì)學(xué)意義，miR-148b inhibitor 高糖組 AMPKα的表達(dá)顯著上調(diào)（p<0.05）3，表明 miR-148b inhibitor 成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入 HK-2 細(xì)胞，并且靶向調(diào)控 AMP，發(fā)揮其相應(yīng)的效用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

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本文編號(hào)：2647314