【摘要】：研究背景與目的糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,也是終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因,同時(shí),它也被認(rèn)為是許多心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但目前關(guān)于其發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制還不完全清楚。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)溶酶體的降解途徑之一,目的是去除細(xì)胞內(nèi)過量的蛋白質(zhì)聚集體,同時(shí)清除掉受損或多余的細(xì)胞器,從而保持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境平衡。自噬可由各種應(yīng)激條件(比如缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或氧化應(yīng)激)激活,而肥胖或糖尿病所致的代謝功能障礙可損害自噬作用。研究證明,DKD狀態(tài)下腎臟自噬水平明顯受抑制,激活自噬可以起到保護(hù)腎臟的作用。Klotho是一種抗衰老因子,并且其選擇性地高表達(dá)于腎臟,特別是腎小管上皮細(xì)胞,目前普遍觀點(diǎn)認(rèn)為其是一種主要由腎臟分泌的激素,在各種急、慢性腎臟病中發(fā)揮著保護(hù)作用。在DKD早期階段,患者血清中的Klotho蛋白已呈下降趨勢(shì),并且其下降幅度隨著DKD的進(jìn)展越來越明顯。因此,血清Klotho蛋白下降的水平被認(rèn)為是DKD進(jìn)展水平的重要生物標(biāo)志物之一。目前,在糖尿病腎臟病方面尚無關(guān)于klotho與自噬的關(guān)系的研究。本研究旨在研究DKD狀態(tài)下klotho與自噬的相關(guān)性,并且探索klotho是否可通過AMPK及ERK通路來改善腎臟自噬水平,從而起到腎臟保護(hù)作用,為進(jìn)一步理解klotho及自噬在糖尿病腎臟病的發(fā)病機(jī)制上提供新的理論依據(jù)。方法1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)用STZ/HFD方法構(gòu)建好的糖尿病(DM組)小鼠模型,使用同種正常(control組)小鼠作為對(duì)照。取1w、6w、18w的DM組和control組小鼠的腎臟組織,通過RT-qPCR、westernblot等方法來檢測其分子生物學(xué)指標(biāo),免疫組化法分析腎皮質(zhì)中LC3B蛋白表達(dá)情況。同時(shí),在DM組小鼠造模12w時(shí)通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方法構(gòu)建出腎臟klotho過表達(dá)模型,取腎臟組織行RT-qPCR、western blot方法檢測分子生物學(xué)指標(biāo),免疫組化法分析腎皮質(zhì)中LC3B蛋白表達(dá)情況。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室保存的人腎小管上皮細(xì)胞株(HK2),用含10%FBS的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并放置在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,待培養(yǎng)基變黃或每3天更換培養(yǎng)基一次。當(dāng)其在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上長至約80%時(shí),便將其消化后接種于6孔板中,按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及時(shí)間梯度進(jìn)行分組:24h/空載質(zhì)粒對(duì)照組(pcDNA-Vector)+klotho 過表達(dá)組(pcDNA-klotho);48h/pcDNA-Vector +pcDNA-klotho;72h/pcDNA-Vector + pcDNA-klotho。細(xì)胞饑餓 12-24h 后,轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒并改用高糖(Glu30mM)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收板后行RT-qPCR、western blot檢測分子生物學(xué)指標(biāo),電鏡觀察細(xì)胞自噬體形態(tài)。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)通過Trizol法提取出組織及細(xì)胞的總mRNA。添加M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑以使得mRNA能夠逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR法在羅氏480 PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),按2-△△Ct方法計(jì)算得出目的基因表達(dá)量。4、免疫印跡(Western Blot)通過RIPA法提取出組織及細(xì)胞的總蛋白質(zhì)。配制SDS-PAGE分離膠,添加蛋白樣品,經(jīng)電泳儀分離后,濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上,隨后封閉液封閉PVDF膜。4℃下一抗孵育搖床過夜后,室溫下二抗孵育1-2h,TBST漂洗。使用天能Tanon 5500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)發(fā)光顯影,Image J軟件分析結(jié)果。5、免疫組織化學(xué)取新鮮的小鼠腎臟標(biāo)本,用4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋、切片。經(jīng)過脫蠟、水化、抗原修復(fù)和封閉后,用兔抗LC3多克隆抗體孵育,再孵二抗,用DAB顯色后蘇木素復(fù)染,再經(jīng)藍(lán)化和脫水后中性樹膠封片,正置顯微鏡下觀察玻片并拍照。6、電鏡用電鏡固定液、鋨酸等固定細(xì)胞標(biāo)本后,梯度酒精及丙酮脫水,丙酮及812包埋劑滲透,隨后包埋并行超薄切片。使用鈾鉛雙染色的方法染色后,使用透射電子顯微鏡觀察拍照,采集圖像進(jìn)行分析。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,并使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)的方式表示,多組數(shù)據(jù)之間的比較則采用單因素方差分析,正態(tài)分布兩樣本之間的比較則采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),當(dāng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的P值0.05時(shí),被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1、klotho和LC3B在不同病程階段的糖尿病小鼠腎臟的表達(dá)差異(1)與control組相比,造模后1w的DM組的klothomRNA稍有下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;6w時(shí)呈明顯降低趨勢(shì);18w時(shí)進(jìn)一步降低。(2)與control組相比,DM組小鼠在1w時(shí)LC3B水平稍增高,而6w和18w時(shí),DM組均呈現(xiàn)明顯的自噬受損情況,且18w時(shí)自噬受損幅度較6w更大。(3)與control組相比,18w時(shí)DM小鼠腎皮質(zhì)的LC3B蛋白的表達(dá)明顯減少,在klotho的主要表達(dá)區(qū)域——腎小管尤為明顯。2、糖尿病小鼠過表達(dá)klotho后腎皮質(zhì)自噬的改變(1)通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方法構(gòu)建的pCMV-Klotho的小鼠的腎皮質(zhì)中klotho mRNA 明顯高于 pCMV-Vector 小鼠。(2)與pCMV-Vector組相比,pCMV-Klotho組的小鼠腎臟皮質(zhì)的LC3B蛋白含量明顯增高。(3)pCMV-Klotho組的小鼠腎臟皮質(zhì)的LC3B蛋白在腎小管區(qū)域表達(dá)明顯升高,這和klotho的表達(dá)區(qū)域一致。3、高糖培養(yǎng)的HK2細(xì)胞過表達(dá)klotho后體內(nèi)自噬的改變(1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后高糖培養(yǎng)24h后,pcDNA-Klotho組相比于pcDNA-Vector組,細(xì)胞中klotho mRNA明顯升高。(2)在pcDNA-Vector組中,相比于高糖培養(yǎng)24h和48h組,72h組的LC3B含量明顯下降。(3)與 pcDNA-Vector 相比,pcDNA-Klotho 組體內(nèi) LC3B 的含量升高,二者差異在72h時(shí)最為明顯。(4)電鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和高糖培養(yǎng)72h后的HK2細(xì)胞,顯示pcDNA-Klotho組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見顯著的包裹了受損細(xì)胞器及其他胞漿成分的自噬體,而pcDNA-Vector未見到明顯的自噬體結(jié)構(gòu)。4、klotho對(duì)DKD下腎臟自噬的作用機(jī)制研究(1)pCMV-Klotho組的糖尿病小鼠相比于pCMV-Vector組的小鼠腎皮質(zhì)的AMPK磷酸化水平更高,ERK的磷酸化水平降低。(2)pcDNA-Klotho組的HK2細(xì)胞體內(nèi)依然可以觀察到AMPK磷酸化水平的升高和ERK磷酸化水平的降低。結(jié)論1、DKD狀態(tài)下,小鼠腎臟皮質(zhì)的klothomRNA表達(dá)逐漸降低,且自噬作用的下降幅度越來越大,這與klotho的表達(dá)趨勢(shì)一致。2、隨著高糖刺激的延長,人腎小管上皮細(xì)胞的自噬受抑制的情況越來越明顯。3、過表達(dá)klotho可以引起糖尿病小鼠的腎臟皮質(zhì)的自噬水平上調(diào),在高糖培養(yǎng)的HK2細(xì)胞晚期依然可以上調(diào)自噬水平。4、Klotho可以上調(diào)AMPK磷酸化和下調(diào)ERK磷酸化的表達(dá),這可能是其改善DKD下的腎臟自噬受抑制情況的機(jī)制之一。
【圖文】：

而在一般情況下，未特殊說明時(shí)的自噻均默認(rèn)為巨自嗤，這也是現(xiàn)在研逡逑宄最多的自噬類型。逡逑以巨自噬為例，自噬可簡單概括為以下幾個(gè)基本過程［１６］（圖１）：逡逑（１）

圖２自噬過程中相關(guān)分子機(jī)制［１８］逡逑３．３自噬的相關(guān)通路逡逑除了細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激外，營養(yǎng)狀態(tài)的改變也會(huì)調(diào)節(jié)自噬。當(dāng)營養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬逡逑被顯著誘導(dǎo)。相反，在營養(yǎng)過剩時(shí)，自噬被明顯抑制。目前己知的自噬潛在調(diào)節(jié)逡逑因子主要有ｍＴＯＲＣｌ、ＥＲＫ、ＡＭＰＫ和Ｓｉｒｔｌ，，它彳門直接或間接調(diào)節(jié)自噬。營養(yǎng)逡逑過剩時(shí)，如高糖環(huán)境下，ｍＴＯＲＣｌ激活、ＡＭＰＫ和Ｓｉｒｔｌ減少、ＥＲＫ的活化，這逡逑些都能抑制自噬｜１４］。逡逑３．３．１邋ｍＴＯＲ信號(hào)通路逡逑ｍＴＯＲ邋（邋ｍａｍｍａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋Ｒａｐａｍｙｃｉｎ，雷帕霉素革巴蛋白）是一種絲氨酸／＇））、逡逑５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Munehiro Kitada;Keizo Kanasaki;Daisuke Koya;;Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease[J];World Journal of Diabetes;2014年03期

2 許嶸;鐘一紅;陳波;袁敏;方藝;林靜;蔣素華;徐夏蓮;龔邵敏;衡艷艷;丁小強(qiáng);金泰^

本文編號(hào)：2642328