發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 15:15

【摘要】：目的糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)作為常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥,已成為全世界終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因。降糖策略被認(rèn)為是保護(hù)腎臟的主要方式,然而仍有一部分病人腎功能在有效降糖后仍然惡化。因此,尋找一種既能有效降糖又能阻止DKD進(jìn)展的藥物迫在眉睫。沙格列汀作為二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制劑已成為治療2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的新型藥物。沙格列汀對(duì)腎臟具有保護(hù)作用,而其確切機(jī)制尚未明確。DPP-4具有酶活性,SDF-1α是DPP-4的天然底物,DPP-4可將有活性的SDF-1α降解為失去活性的SDF-1α,而沙格列汀作為DPP-4抑制劑,能夠抑制SDF-1α降解。SDF-1α對(duì)腎臟具有保護(hù)作用,可激活下游因子PKA磷酸化。氧化應(yīng)激與DKD的病理生理機(jī)制密切相關(guān),能夠被PKA磷酸化所抑制。足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是導(dǎo)致蛋白尿的潛在途徑,氧化應(yīng)激可促進(jìn)足細(xì)胞EMT。本研究以高脂飼料(high fat diet,HFD)聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的T2DM大鼠和條件永生性小鼠足細(xì)胞系為研究對(duì)象,通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),研究并探討沙格列汀通過(guò)抑制DPP-4酶活性,阻止SDF-1α降解,改善氧化應(yīng)激和足細(xì)胞EMT,預(yù)防DKD的機(jī)制。方法1.體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)將45只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取15只給予給予標(biāo)準(zhǔn)飼料(chow diet,CD)喂養(yǎng),為CD組,其余30只SD大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng),為HFD組。喂養(yǎng)10周后,監(jiān)測(cè)各組大鼠體重、血糖、血脂、腎功能、肝功能等指標(biāo),并通過(guò)腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)實(shí)驗(yàn)評(píng)估胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。隨后HFD組大鼠給予小劑量STZ 25mg/kg尾靜脈注射。以血糖≥16.7mmol/l作為誘導(dǎo)T2DM模型成功標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后,將T2DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM)和沙格列汀干預(yù)組(DM+Sax),給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)的15只大鼠繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),為空白對(duì)照組(NC)。每周監(jiān)測(cè)每組大鼠體重、血糖,12周末留取24h尿檢測(cè)尿微量白蛋白(urine microalbumin,UMA)。沙格列汀治療12周后處死大鼠,留取血標(biāo)本檢測(cè)各組大鼠血脂、腎功能、肝功能等指標(biāo)。左腎迅速摘除并稱重。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組大鼠尿中氧化應(yīng)激標(biāo)記分子8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)、尿足細(xì)胞損傷分子Mindin水平。應(yīng)用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色和過(guò)碘酸希夫染色(periodic acid-Schiff staining,PAS)觀察各組大鼠腎臟基本結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。借助電鏡觀察各組大鼠足細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)。應(yīng)用生物樣品DPPIV/CD26檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清和腎臟中DPP-4酶活性。應(yīng)用免疫熒光染色觀察腎臟組織切片Desmin、Nephrin、Podocin、DPP-4表達(dá)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎臟組織切片中Fibronectin、Fsp1、SDF-1α、NOX2表達(dá)。采用DHE染色觀察各組大鼠ROS水平。采用western blot法檢測(cè)各組大鼠腎臟DPP-4、SDF-1α、p-PKA、PKA、NOX2、p-ERK1/2、ERK1/2、TGF-β1、α-SMA、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白水平。2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):條件永生性小鼠足細(xì)胞系在33℃含IFN-γ培養(yǎng)條件下增殖,37℃無(wú)IFN-γ培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10~14天誘導(dǎo)分化。然后將細(xì)胞分成5組:(1)正常葡萄糖組(NG)作為對(duì)照組,培養(yǎng)于含5.6mmol/l D-葡萄糖的RPMI 1640中;(2)甘露醇對(duì)照組(MA)作為等滲對(duì)照組,培養(yǎng)于含5.6mmol/l D-葡萄糖和24.4mmol/l甘露醇的RPMI 1640中;(3)高糖干預(yù)組(HG),培養(yǎng)于含30mmol/l D-葡萄糖的RPMI 1640中;(4)高糖與沙格列汀干預(yù)組(HG+Sax),培養(yǎng)于含30mmol/l的RPMI 1640中,并用500nmol/l沙格列汀處理;(5)高糖、沙格列汀及AMD3100干預(yù)組(HG+AMD3100+Sax),培養(yǎng)于含30mmol/l D-葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基,并使用SDF-1α受體拮抗劑AMD3100 20μg/ml預(yù)處理后,加入沙格列汀使其濃度為500nmol/l進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用生物樣品DPPIV/CD26檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組足細(xì)胞DPP-4酶活性。應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)各組足細(xì)胞ROS水平。通過(guò)western blot法檢測(cè)各組足細(xì)胞DPP-4、SDF-1α、p-PKA、PKA、NOX2、p-ERK1/2、ERK1/2、TGF-β1、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白水平。結(jié)果一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2型糖尿病大鼠造模成功對(duì)SD大鼠分別給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和高脂飼料干預(yù)10周后,HFD組大鼠體重和血脂較CD組大鼠明顯增加(P0.05),IPGTT結(jié)果顯示HFD組大鼠存在胰島素抵抗,且經(jīng)過(guò)小劑量尾靜脈注射STZ后,大鼠存在明顯的多飲、多尿、多食、體重減輕等癥狀,隨機(jī)血糖≥16.7mmol/l,提示T2DM大鼠造模成功。2.沙格列汀降低2型糖尿病大鼠尿微量白蛋白給予沙格列汀治療12周后,DM組和DM+Sax組大鼠血糖較NC組顯著升高(P0.05),DM+Sax組血糖較DM組降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與NC組相比,24h UMA在DM組和DM+Sax組中顯著升高(P0.05),而與DM組相比,沙格列汀干預(yù)后24h UMA明顯改善(P0.05)。3.沙格列汀改善2型糖尿病大鼠腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積和足細(xì)胞結(jié)構(gòu)HE、PAS染色結(jié)果顯示,NC組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,表現(xiàn)為腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清楚,腎小球大小未見(jiàn)明顯異常。DM組大鼠系膜基質(zhì)彌漫性增生,給予沙格列汀后有所改善。電鏡結(jié)果顯示,NC組大鼠足細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,而DM組大鼠足細(xì)胞足突融合,DM+Sax組大鼠給藥后足細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到一定程度恢復(fù)。4.沙格列汀抑制2型糖尿病大鼠足細(xì)胞EMT免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色和western blot結(jié)果顯示,DM組大鼠Fibronectin、Fsp1、TGF-β1、α-SMA、Desmin表達(dá)水平較NC組顯著升高(P0.05),Nephrin、Podocin表達(dá)水平較NC組顯著下降(P0.05),提示T2DM大鼠存在足細(xì)胞EMT現(xiàn)象。與DM組相比,沙格列汀治療后大鼠Fibronectin、Fsp1、TGF-β1、α-SMA、Desmin表達(dá)水平明顯下降(P0.05),Nephrin、Podocin表達(dá)水平明顯升高(P0.05),提示沙格列汀抑制T2DM大鼠足細(xì)胞EMT現(xiàn)象。5.沙格列汀抑制DPP-4酶活性和SDF-1α降解與NC組相比,DM組大鼠血清和腎臟DPP-4酶活性明顯升高(P0.05),而DM+Sax組大鼠血清和腎臟DPP-4酶活性較DM組明顯下降(P0.05)。通過(guò)免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色和western blot方法觀察到,與NC組大鼠相比,DM組大鼠DPP-4表達(dá)水平顯著升高(P0.05),SDF-1α表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。給予沙格列汀治療后,與DM組大鼠相比,DPP-4表達(dá)水平顯著下降(P0.05),SDF-1α表達(dá)水平顯著增加(P0.05),提示沙格列汀抑制DPP-4酶活性,抑制SDF-1α降解。6.沙格列汀抑制2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、DHE染色和western blot方法,本研究發(fā)現(xiàn),與NC組大鼠相比,DM組大鼠PKA磷酸化水平顯著下降(P0.05),NOX2、ROS、p-ERK1/2蛋白水平顯著升高(P0.05)。與DM組大鼠相比,給予沙格列汀治療后PKA磷酸化水平顯著升高(P0.05),而NOX2、ROS、p-ERK1/2水平顯著下降(P0.05)。二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.沙格列汀抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMTDPPIV/CD26檢測(cè)試劑盒、熒光探針DCFH-DA、western blot結(jié)果顯示,沙格列汀顯著抑制DPP-4酶活性和蛋白水平(P0.05),抑制SDF-1α降解(P0.05),促進(jìn)PKA磷酸化(P0.05),抑制NOX2、ROS、p-ERK1/2水平(P0.05),抑制TGF-β1、Desmin表達(dá)(P0.05),改善足細(xì)胞Nephrin、Podocin表達(dá)(P0.05)。2.沙格列汀通過(guò)SDF-1α抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT熒光探針DCFH-DA、western blot結(jié)果顯示,與HG+Sax組相比,HG+AMD3100+Sax組足細(xì)胞PKA磷酸化水平顯著下降(P0.05),NOX2、ROS、p-ERK1/2水平顯著升高(P0.05),TGF-β1、Desmin表達(dá)顯著升高(P0.05),足細(xì)胞Nephrin、Podocin表達(dá)顯著下降(P0.05)。結(jié)論1.沙格列汀獨(dú)立于降糖作用改善T2DM大鼠UMA。2.沙格列汀通過(guò)抑制DPP-4酶活性,抑制SDF-1α降解,改善氧化應(yīng)激,抑制足細(xì)胞EMT,阻止DKD發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文0%。抑制 DPP-4 酶活性，血漿中有活性的 GIP 和 GLP-1 可以增加 2 倍到 3]。DPP-4 抑制劑治療 T2DM 中的作用在于阻止 GIP 和 GLP-1 降解，延長(zhǎng)它作用時(shí)間（圖 1B），給予 DPP-4 抑制劑使循環(huán)中的 GLP-1 雙倍增加[6]。DPP制劑作用效果歸因于 GLP-1 受體激動(dòng)劑的作用，包括以葡萄糖依賴的方式胰島素和抑制胰高血糖素分泌[6]。另外，，該類藥物對(duì)體重影響為輕度或中度，單獨(dú)使用不增加低血糖風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前臨床使用的 DPP-4 抑制劑主要有西格列汀、維格列汀、沙格列汀、列汀、利格列汀，本研究的研究對(duì)象為沙格列汀。

6圖 2 足細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[32]注：（a）腎小球結(jié)構(gòu)；（b）掃描電鏡下的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)；（c）透射電鏡下的濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)；（d）足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)；GBM，腎小球基底膜；E，內(nèi)皮細(xì)胞；CL,毛細(xì)血管腔；M，系膜細(xì)胞；FP，足突；CB，細(xì)胞體；MP，主突；BS，Bowman 囊；AA，入球小動(dòng)脈；DT，遠(yuǎn)端小管；EE，出球小動(dòng)脈；PE，頂葉上皮；PT，近端小管；AMD，頂部；BMD，基底部相鄰的足突由高度分化的細(xì)胞連接部在側(cè)面鏈接，稱為 SD，SD 是一種多蛋白復(fù)合物，由 Nephrin、Podocin 等蛋白構(gòu)成，其完整性對(duì)于防止蛋白尿過(guò)濾必不可少。Nephrin 是一種 1 型跨膜蛋白，Nephrin 分子可以相互作用，使 SD 看起來(lái)像拉鏈，對(duì)阻止蛋白尿具有重要作用[33]。Podocin 也是一種 SD 蛋白，它通過(guò)其中心部分錨定在膜上，并幫助 Nephrin 錨定在質(zhì)膜上，在阻止蛋白尿產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[33]。血漿穿過(guò)有孔的內(nèi)皮細(xì)胞、GBM 和 SD，由毛細(xì)血管腔到鮑曼囊。SD 在足細(xì)胞 FP 之間的濾過(guò)孔中起連接作用，從而建立防止尿蛋白丟失的最終屏障（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2641625