發(fā)布時(shí)間：2020-04-21 06:30

【摘要】：[目的]1、培養(yǎng)、提純與標(biāo)記SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),用于后續(xù)進(jìn)行同種異體輸注治療。2、建立類似于人類慢性腎臟病的阿霉素腎病大鼠模型。3、通過(guò)不同途徑移植標(biāo)記后的BMSCs,并通過(guò)觀察移植后大鼠的腎功能改善、腎臟組織中BMSCs的分布從而分析療效最優(yōu)通道。繼而對(duì)臨床上對(duì)于慢性腎臟病的治療工作提供借鑒意義。[方法]1、選擇2只雄性12周齡清潔級(jí)SD大鼠,取骨髓作供體細(xì)胞來(lái)源。將其處死后,在無(wú)菌條件下取出股骨及脛腓骨,從其骨髓腔內(nèi)提取BMSCs進(jìn)行分離、提純,由流式細(xì)胞學(xué)鑒定,確定為目標(biāo)所需細(xì)胞后,傳代培養(yǎng)至P4-P6,用Ad5/F35腺病毒載體(帶綠色熒光)轉(zhuǎn)染液標(biāo)記。2、隨機(jī)選擇60只雄性14周齡清潔級(jí)SD大鼠,切除左腎并于手術(shù)當(dāng)天、1周后、2周后,通過(guò)尾靜脈以3mg/kg劑量輸注阿霉素建立慢性腎病模型。同時(shí)選擇12只大鼠作為空白對(duì)照。末次輸注阿霉素后第4周,對(duì)造模后大鼠的尿蛋白、血生化進(jìn)行分析。3、選擇成功造模的48只大鼠,隨機(jī)分為4組,每組12只:A組:經(jīng)動(dòng)脈介入途徑輸注BMSCs并在兩周后于同一路徑輸注等量BMSCs;V組:經(jīng)尾靜脈途徑輸注BMSCs并在兩周后于同一路徑輸注等量BMSCs;IP組:經(jīng)腹腔注射途徑輸注BMSCs并在兩周后于同一路徑輸注等量BMSCs;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的量為1X 106個(gè)/ml混懸液2.5ml。ADR組:不輸注BMCSs,僅在其他組輸注BMSCs時(shí)通過(guò)尾靜脈輸注等量生理鹽水。12只健康大鼠作為空白組N組,同樣在其他組輸注BMSCs時(shí)經(jīng)尾靜脈輸注2.5ml生理鹽水。分別于末次移植后0周(當(dāng)周)、1周、2周取血。檢測(cè)大鼠血液中血紅蛋白和血肌酐,收集24h尿液檢測(cè)24h尿蛋白。并在此三個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取4只大鼠(A組前兩次分別只取3只)處死取出右腎組織觀測(cè)BMCSs在腎內(nèi)的分布情況。[結(jié)果]1、最初的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈典型的貼壁生長(zhǎng)特性(24-48小時(shí)),傳代1周后,細(xì)胞呈圓形、不規(guī)則多角形,僅有少數(shù)呈長(zhǎng)梭形。傳至P4代時(shí),BMSCs生長(zhǎng)速度加快,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,呈長(zhǎng)梭形。取傳代至P4至P6的BMSCs做流式細(xì)胞儀表型鑒定,其中CD45、CD11b、CD29及CD44表面標(biāo)志陽(yáng)性表達(dá)分別為2.2%、1.9%、97.1%、和97.9%。AD5/F35腺病毒轉(zhuǎn)染后6小時(shí),換培養(yǎng)液培養(yǎng)一天后觀察綠色熒光的表達(dá)率為75%。2、造模時(shí)死亡5只,造模失敗3只,成功造模52只,取2只處死進(jìn)行腎臟病理切片,取2只作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)A組插管失敗導(dǎo)致死亡的補(bǔ)充。末次輸注阿霉素后第4周,造模后大鼠檢測(cè)血肌酐及血尿素氮明顯上升,24h尿蛋白升高,血清白蛋白下降。觀察病理切片:腎臟形態(tài)呈硬化、萎縮狀,部分腎小球出現(xiàn)局灶性硬化,腎小管管腔擴(kuò)張,腎間質(zhì)有炎癥、纖維化表現(xiàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查與病理改變,說(shuō)明大鼠造模成功。3、A組進(jìn)行第一次BMSCs移植時(shí),術(shù)后失血過(guò)多死亡1只,補(bǔ)充1只造模成功大鼠;第二次骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)中死亡1例,術(shù)后死亡1例。V組和IP組無(wú)死亡病例。移植后A組、V組、IP組和ADR組在0、1、2周時(shí),血肌酐、血尿素氮、24小時(shí)尿蛋白指數(shù)均明顯高于N組(P0.01)。0周時(shí),A組、V組、IP組與ADR組比較,血肌酐、血尿素氮、24小時(shí)尿蛋白均無(wú)明顯改變。1周時(shí)A組血清肌酐明顯低于ADR組(P0.01),而V組和ADR組血清肌酐無(wú)明顯改善;一周時(shí)與ADR組比較,A組和V組的24小時(shí)尿蛋白均有降低,且A組24小時(shí)尿蛋白明顯低于V組(P0.01)。2周時(shí),血肌酐數(shù)值A(chǔ)組低于V組和阿霉素組(P0.01),但V組與ADR組無(wú)顯著性差異;A組和V組24小時(shí)尿蛋白低于ADR組(P0.01),A組與V組無(wú)顯著性差異。各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上IP組與ADR組比較,各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯差異。病理學(xué)檢查顯示,ADR組和IP組出現(xiàn)局灶性腎小球硬化硬化,基底膜和系膜細(xì)胞增生,間質(zhì)部分有大量炎性細(xì)胞;V組的腎小球基膜及系膜細(xì)胞出現(xiàn)不同程度增生,間質(zhì)部分少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);A組大部分腎小球出現(xiàn)毛細(xì)血管襻擴(kuò)張,間質(zhì)部分極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);N組病理顯示與正常大鼠腎臟病理一致。檢測(cè)綠色熒光顯示:N組、ADR組、IP組基本沒(méi)有顯示綠色熒光;V組、A組于移植后第一天起即出現(xiàn)綠色熒光,并隨時(shí)間推移逐漸增強(qiáng),于14天時(shí)為最強(qiáng);V組綠色熒光主要表達(dá)于腎小管部分,而A組不僅分布于腎小管,同時(shí)在腎小球部分也可看見(jiàn)少量分布。[結(jié)論]1、通過(guò)細(xì)胞特征檢測(cè),獲得細(xì)胞為高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,是實(shí)驗(yàn)所需的目標(biāo)細(xì)胞,使用腺病毒轉(zhuǎn)染后可成功使其帶有綠色熒光。2、單側(cè)腎切除和3次經(jīng)尾靜脈輸注阿霉素可引起大鼠慢性腎臟病。此方法較為安全,是一種可重復(fù)、穩(wěn)定、有效的造模方法。3、移植同種異體的BMSCs因輸注途徑不同可對(duì)慢性腎臟病大鼠產(chǎn)生不同情況的治療效果:腹腔注射不能改善腎功能,動(dòng)脈介入途徑及外周靜脈輸注均可對(duì)大鼠腎功起到改善的效果,且通過(guò)動(dòng)脈途徑的效果優(yōu)于外周靜脈途徑效果。改善腎功的具體表現(xiàn)在于抑制大鼠的血尿素氮、血肌酐升高;提高血紅蛋白,改善貧血;降低尿蛋白量,提高血清白蛋白。
【圖文】：

ＣＤｌｌｂ的陽(yáng)性率表達(dá)僅有２．邋２％、１．邋９％，而ＣＤ２９及ＣＤ４４表面標(biāo)志陽(yáng)性表達(dá)高達(dá)逡逑９７．邋１％和邋９７．邋９％。逡逑經(jīng)過(guò)ＡＤ５／Ｆ３５腺病毒轉(zhuǎn)染后６小時(shí)，換培養(yǎng)液培養(yǎng)一天后觀察綠色熒光的表逡逑達(dá)率為７５％，細(xì)胞和正常培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)一致，呈多邊形，無(wú)顯著差異（圖１－２）。逡逑

圖２．邋２－１造模后大鼠腎組織ＨＥ邋（Ｘ１００）圖２．邋２－２造模后大鼠腎組織ＨＥ邋（Ｘ２００）逡逑３．介入途徑腎動(dòng)脈造影結(jié)果逡逑Ａ組第一次行介入途徑腎動(dòng)脈插管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，由于手術(shù)時(shí)間逡逑過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致術(shù)后失血過(guò)多／感染，，導(dǎo)致一例死亡，由造模后剩余２只大鼠隨機(jī)選逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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1 張文君;王文革;梁耀軍;周小春;王曉玲;李靜晶;史慧;何升林;王勾琴;王金華;趙鵬鳴;萬(wàn)廷信;雷霖;王儉勤;;甘肅省終末期腎病患者的臨床特征和治療現(xiàn)狀[J];中華腎臟病雜志;2015年08期

2 白彝華;王家平;王劍松;蔣紅櫻;楊敏;;經(jīng)腎動(dòng)脈插管造影骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)阿霉素腎病大鼠的影響[J];中國(guó)臨床研究;2015年06期

3 邊曉慧;何平;孫廣萍;孫立;李德天;馮江敏;;慢性腎衰竭模型中透明質(zhì)酸和CD_(44)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及修復(fù)作用的影響[J];中國(guó)全科醫(yī)學(xué);2014年18期

4 邊曉慧;趙桂鋒;孫立;劉娜;李德天;馮江敏;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞延緩大鼠殘腎模型腎纖維化的研究[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

5 張?chǎng)?陳香宇;何巧玉;王閃;李春燕;段芳齡;黃華;;經(jīng)不同方式移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化的療效[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2013年06期

6 林楚偉;周勝華;戴海鷹;鄧平;尹芝蘭;關(guān)賢頌;夏欣;;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌中的作用[J];中國(guó)組織工程研究;2012年27期

7 李芳;胡祥;趙紅梅;賈丹兵;黨智杰;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不同輸注途徑對(duì)急性腎小管壞死的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年40期

8 萬(wàn)建新;郭琦;潘陽(yáng)彬;崔炯;傅檳檳;許艷芳;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)損傷腎小管上皮細(xì)胞:可能與可行?[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年32期

9 董晨;楊煥丹;豐炳峰;關(guān)鳳軍;趙彤;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟nephrin表達(dá)的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年32期

10 楊煥丹;董晨;關(guān)鳳軍;高莉莉;趙彤;豐炳峰;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)嘌呤霉素氨基核苷腎病大鼠足細(xì)胞修復(fù)作用的研究[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2010年06期

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1 韓超楠;PMSC移植對(duì)UUO梗阻性腎病模型大鼠腎小管間質(zhì)纖維化及Th17/Treg平衡的研究[D];上海交通大學(xué);2014年

2 鄒毓華;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素腎病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

3 李金東;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞三種移植途徑在急性腎梗阻模型中的歸巢研究[D];中南大學(xué);2012年

4 程慶;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞包膜下移植對(duì)梗阻腎病變影響的初步研究[D];中南大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2635473