【摘要】：慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)為威脅人類健康的世界性臨床醫(yī)學(xué)難題。在CKD早期,腎臟功能處于代償期,但隨著病情進(jìn)展,最終將變?yōu)榻K末期腎臟病(End stage renal disease,ESRD),腎臟功能完全喪失,此時(shí)腎臟組織的主要病理變化包括腎小球硬化,腎小管萎縮以及腎間質(zhì)纖維化等,其中腎間質(zhì)纖維化被認(rèn)為是所有CKD的最終結(jié)局。在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)起了十分重要的作用。CKD早期MMP-2活性升高,促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)產(chǎn)生增多;隨著CKD的進(jìn)一步發(fā)展,MMP-2表達(dá)增加但活性降低,最終使得ECM的合成多于降解,促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。在CKD晚期,MMP-2活性降低的具體機(jī)制不清。已知缺氧是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要原因;且MMP-2的活化主要在胞膜表面進(jìn)行,活化后MMP-2才可發(fā)揮功能,因此膜結(jié)構(gòu)重塑可能影響MMP-2的活性。缺氧細(xì)胞內(nèi)吞活躍,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)重塑加強(qiáng)。那么CKD晚期,MMP-2的活性下降是否與缺氧導(dǎo)致的內(nèi)吞活動(dòng)加強(qiáng)有關(guān)?我們前期工作證實(shí),缺氧時(shí)人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)內(nèi)吞加強(qiáng),上清中MMP-2活性減低;而抑制其內(nèi)吞關(guān)鍵基因Caveolin-1后MMP-2活性增高。因此我們提出,缺氧時(shí)HK-2細(xì)胞內(nèi)吞加強(qiáng),使MMP-2的活化受影響,導(dǎo)致MMP-2活性下降,從而加重腎間質(zhì)纖維化。但內(nèi)在機(jī)制有待明確。Src是酪氨酸蛋白激酶家族的重要成員,缺氧可致Src磷酸化[phospho-Src(Tyr416)]。p-Src(Tyr 416)分子可調(diào)節(jié)多種與纖維化相關(guān)的膜受體信號(hào)通路,如:TGF-β/Smad、STAT3、EGFR等通路。已有研究證實(shí),當(dāng)Src在Tyr 416位點(diǎn)的活化被抑制后,腎間質(zhì)纖維化可得到顯著緩解。那么腎間質(zhì)纖維化過程中細(xì)胞內(nèi)吞所致的MMP-2的活性變化與Src之間有無聯(lián)系?在腎間質(zhì)纖維化時(shí),腎組織中因缺氧而活化的Src分子是否可能通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞而干擾MMP-2的活化?為解決這些問題,我們開展了以下研究。首先通過改良方法建立環(huán)孢素A(Cyclosporin A,Cs A)誘導(dǎo)的缺氧性小鼠腎間質(zhì)纖維化模型,并對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)估。在初步成功的基礎(chǔ)上,又建立了Cs A誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化模型,從整體水平觀察了纖維化腎臟組織中MMP-2的活性、細(xì)胞內(nèi)吞調(diào)節(jié)分子Caveolin-1以及Src分子的表達(dá)變化情況。然后通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)Src調(diào)節(jié)MMP-2活性的機(jī)制進(jìn)行研究。利用缺氧培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,模擬腎纖維化組織的缺氧微環(huán)境,并利用Src活化的選擇性抑制劑PP1干擾Src活化;檢測(cè)Src、Caveolin-1、內(nèi)吞以及MMP-2的活性變化情況。了解Src是否通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞而對(duì)MMP-2的活化產(chǎn)生干擾。第一部分利用改良方法建立小鼠及大鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型Ⅰ.利用改良方法建立小鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型目的Cs A誘導(dǎo)的小鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化是建立缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型的常用方法之一。傳統(tǒng)的建模方法為小鼠皮下注射Cs A,同時(shí)飼喂0.01%低鈉飼料。但目前Cs A的臨床應(yīng)用多以口服為主,因此若以灌胃法建模能更準(zhǔn)確的模擬臨床。同時(shí)在建模過程中低鈉飼料必不可少,但其價(jià)格高,制作費(fèi)時(shí),且含鈉量有時(shí)難以達(dá)到如此低的要求;而呋塞米是臨床常用藥物,簡單易得,有強(qiáng)大的排鈉作用,可以很好的模擬低鈉環(huán)境。因此本研究擬利用灌胃法替代皮下注射法,同時(shí)利用呋塞米替代低鈉飼料,為該模型的建立提供一種改良的方法。方法小鼠隨機(jī)分為Cs A+呋塞米組、Cs A組、呋塞米組、葵花籽油組、蒸餾水組、空白對(duì)照組等6組。日常觀察小鼠一般情況,每4 d記錄一次小鼠體重變化,并根據(jù)體重調(diào)整藥量。第14 d和28 d時(shí)各組隨機(jī)選取6只小鼠,利用代謝籠收集尿液后,處死小鼠并取血及腎臟組織標(biāo)本。觀察腎臟大體病理形態(tài);檢測(cè)血鈉以及尿鈉;檢測(cè)血肌酐、尿素氮、尿蛋白、肌酐清除率等腎功能指標(biāo);利用Hematoxylin-Eosin(HE)染色、Masson-trichrome(Masson)染色、Periodic Acid-Schiff(PAS)染色等方法行腎臟病理檢查;利用Western blotting方法檢測(cè)各組Vimetin了解腎臟纖維化程度;利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組腎素分泌情況;Western blotting方法還被用于檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表達(dá),以了解腎組織缺氧情況。結(jié)果14 d及28 d時(shí)較其余各組,僅Cs A+呋塞米組小鼠腎臟出現(xiàn)了明顯的纖維化表現(xiàn);同時(shí)該組血鈉較余組減低,尿鈉較余組增高;且該組腎功能指標(biāo)較余組明顯異常;免疫組織化學(xué)染色顯示僅Cs A+呋塞米組小鼠的腎臟組織中有明顯的腎素分泌;Western blotting也顯示僅該組小鼠的腎臟組織中有明顯的Vimentin以及HIF-1α表達(dá)。結(jié)論利用Cs A與呋塞米聯(lián)合灌胃的方法成功建立了小鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型。Ⅱ.利用改良方法建立大鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型目的在實(shí)驗(yàn)I中我們利用Cs A與呋塞米聯(lián)合灌胃的方法成功建立了改良的小鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型。但由于小鼠腎臟體積小,每次可取新鮮組織的量有限,而后續(xù)機(jī)制部分的實(shí)驗(yàn)需要較多新鮮腎臟組織;同時(shí)也為了驗(yàn)證該方法的普適性。故我們擬利用改良方法建立大鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型,并對(duì)造模結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。方法在實(shí)驗(yàn)I的基礎(chǔ)上對(duì)大鼠分組進(jìn)行優(yōu)化,將SD大鼠隨機(jī)分為Cs A+呋塞米組、Cs A+蒸餾水組、呋塞米+葵花籽油組、空白對(duì)照組等4組。日常觀察大鼠一般情況,定期記錄大鼠體重變化,并根據(jù)體重調(diào)整藥量。第14 d和28 d時(shí)各組隨機(jī)選取6只大鼠,利用代謝籠收集尿液后,處死大鼠并取血及腎臟組織標(biāo)本。觀察腎臟大體病理形態(tài);檢測(cè)血肌酐、尿素氮、尿蛋白、肌酐清除率等腎功能指標(biāo);利用HE染色、Masson染色、PAS染色等方法行腎臟病理檢查;利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組Vimetin了解腎臟纖維化程度;利用Western blotting方法檢測(cè)各組HIF-1α的表達(dá),以了解腎組織缺氧情況。結(jié)果14 d及28 d時(shí)較其余各組,僅Cs A+呋塞米組大鼠腎臟出現(xiàn)了明顯的纖維化表現(xiàn);且該組腎功能指標(biāo)較余組明顯異常;免疫組織化學(xué)染色顯示僅Cs A+呋塞米組大鼠的腎臟組織中Vimentin陽性細(xì)胞增加;Western blotting也顯示僅該組大鼠的腎臟組織中有明顯的HIF-1α表達(dá)。結(jié)論利用Cs A與呋塞米聯(lián)合灌胃的方法成功建立了大鼠缺氧性腎間質(zhì)纖維化模型。第二部分大鼠腎臟組織中p-Src(Tyr 416)表達(dá)與MMP-2活性的相關(guān)性觀察目的從整體水平觀察各組大鼠腎臟組織中MMP-2的活性,細(xì)胞內(nèi)吞調(diào)節(jié)分子Caveolin-1以及Src分子的表達(dá)變化情況;并對(duì)大鼠腎臟組織中p-Src(Tyr 416)的表達(dá)與MMP-2活性間的相關(guān)性進(jìn)行觀察。方法將留取的4組大鼠的新鮮腎臟組織裂解并提取蛋白。之后利用Western blotting方法檢測(cè)各組中MMP-2、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)、伴有Kazal基序的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(Reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)、金屬蛋白酶組織抑制因子-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)、Caveolin-1、p-Src(Tyr 416)等的蛋白表達(dá)情況;并利用明膠酶譜法檢測(cè)各組中MMP-2的活性變化情況。最后對(duì)p-Src(Tyr 416)的表達(dá)與MMP-2活性間的相關(guān)性進(jìn)行觀察。結(jié)果纖維化(Cs A+呋塞米組)的大鼠腎臟組織中MMP-2、RECK、TIMP-2、Caveolin-1、p-Src(Tyr 416)的表達(dá)較其余各組明顯升高;但該組中MT1-MMP的表達(dá)以及MMP-2的活性較其余各組明顯減低;p-Src(Tyr 416)的表達(dá)與MMP-2的活性間存在負(fù)相關(guān)。結(jié)論在整體水平,p-Src(Tyr 416)的表達(dá)與MMP-2的活性間存在負(fù)相關(guān)性,p-Src(Tyr 416)可能通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞而對(duì)MMP-2的活化產(chǎn)生干擾。第三部分p-Src(Tyr 416)調(diào)節(jié)MMP-2活性的機(jī)制研究目的通過對(duì)HK-2細(xì)胞的缺氧培養(yǎng)來模擬腎纖維化組織的缺氧微環(huán)境,并利用Src活化的選擇性抑制劑PP1干擾Src活化;檢測(cè)p-Src(Tyr416),內(nèi)吞水平,Caveolin-1,以及MMP-2的活性變化情況,了解Src是否通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞而干擾MMP-2的活化。方法將HK-2細(xì)胞分為常氧組、缺氧組、缺氧+DMSO組以及缺氧+PP1組。并利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)確定PP1的用量以及作用時(shí)間。之后利用Western blotting方法對(duì)各組中HIF-1α、MMP-2、RECK、TIMP-2、MT1-MMP、p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。并利用染料FM4-64FX直接觀察各組的內(nèi)吞活動(dòng)情況。再利用免疫熒光法進(jìn)一步驗(yàn)證各組中RECK、TIMP-2、MT1-MMP的表達(dá)情況。最后利用明膠酶譜法對(duì)各組上清中MMP-2的活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果相較常氧組,缺氧組中p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1表達(dá)升高,內(nèi)吞活動(dòng)加強(qiáng);MMP-2活性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白R(shí)ECK和TIMP-2表達(dá)升高,MT1-MMP表達(dá)減低;MMP-2活性下降。相較缺氧組,缺氧+PP1組中p-Src(Tyr 416)、Caveolin-1表達(dá)減低,內(nèi)吞活動(dòng)減弱;MMP-2活性調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白R(shí)ECK和TIMP-2表達(dá)下降,MT1-MMP表達(dá)升高;MMP-2活性增強(qiáng)。結(jié)論缺氧促進(jìn)Src的磷酸化,活化的Src可以促使HK-2細(xì)胞內(nèi)吞活動(dòng)加強(qiáng),影響MMP-2的活化,導(dǎo)致MMP-2活性下降,加重腎間質(zhì)纖維化。
【圖文】：

1. MMP-2 的表達(dá)和活性調(diào)控。調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜。例如，Notch、P38MAPK 以及 TGF-/Smad 等細(xì)胞信號(hào)通路，可以調(diào)控 pro-MMP-2 的產(chǎn)生。TIMP-2、MT1-MMP 在 pro-MMP-2化生成 MMP-2 的過程中起了十分重要的作用。此外，RECK、TIMP-2、內(nèi)吞、Src 的活和細(xì)胞因子也參與了 MMP-2 的活性調(diào)控。igure 1. The regulation of activity and expression of MMP-2. The regulation mechanism isomplicated. The signal pathways, such as Notch, P38MAPK and TGF-β/Smad, regulate theroduction of pro-MMP-2. TIMP-2 and MT1-MMP also play an important role in the activation ofro-MMP-2 to MMP-2. Additionally, RECK, TIMP-2, endocytosis, Src activation and cytokineslso play an important part in the activity regulation of MMP-2.

圖 2. 在 CKD 早期，當(dāng)腎臟受損傷時(shí)，受損傷的腎臟細(xì)胞以及炎細(xì)胞可以分泌多種與促炎和促纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子，，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。此時(shí)，MMP-2的活性增高，腎臟基底膜受損傷，從而可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致 ECM大量產(chǎn)生、聚積。然而，在 CKD 晚期，MMP-2 的活性減低，從而導(dǎo)致 ECM 的降解不足。因此，腎間質(zhì)纖維化很難逆轉(zhuǎn)。CKD 晚期 MMP-2 活性下降的原因可能與缺氧引起的內(nèi)吞作用增強(qiáng)有關(guān)。①CKD 早期；②CKD 晚期。Figure 2. In the early stage of CKD, when the kidney is injured, the injured cells and theinflammatory cells in kidney will secrete a variety of pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokines,which promote the occurrence of renal interstitial fibrosis. Meanwhile, the activity of MMP-2 isincreased and the renal basement membrane injured, promoting the phenotype transformation ofrenal tubular epithelial cells, at last resulting in the aggravation of ECM deposition. However, inthe advanced stage of CKD, the activity of MMP-2 is decreased and leads to inadequatedegradation of ECM; therefore, the fibrosis is difficult to reverse. The reason for the activity
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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1 姜雋;王勇;李濤;聶利霞;;利用FM4-64FX標(biāo)記大鼠血管平滑肌細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2015年06期

2 譚州科;張子陽;羅茜;唐智;楊亦彬;;慢性環(huán)孢素腎病大鼠模型制作體會(huì)[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年06期

3 生杰;趙久陽;;慢性腎臟病患者鈣磷代謝紊亂與心瓣膜鈣化[J];中國血液凈化;2012年02期

4 張凌;;慢性腎臟病鈣磷代謝紊亂及骨病的處理[J];中國實(shí)用內(nèi)科雜志;2010年02期

5 陳嘉薇;環(huán)孢素A腎毒性機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中華器官移植雜志;2003年04期

6 喬保平,張亞偉,李道明,唐孝達(dá);大鼠口服環(huán)孢素A慢性腎毒性模型的建立[J];中華器官移植雜志;2000年03期

本文編號(hào)：2635177